Mutagénesis al azar - continuación Fermentaciones Industriales por Hector Massaguer

Podremos aumentar la frecuencia de mutaciones mediante el uso de agentes mutágenos, que pueden ser o bien químicos o bien físicos, cuya presencia daña, altera o interfiere en la reparación del DNA. Se pueden emplear diferentes tipos de agentes mutagénicos:

Como se ve en la tabla, cada agente mutágeno tiene características y efectos diferentes, por lo que se deberá elegir siempre el que más se ajuste a las necesidades.
Después del tratamiento obtendremos 3 tipos de organismos:
♦ Parentales: el tratamiento no les ha afectado, no han sufrido mutación.
♦ Mutantes no viables: organismos a los que la dosis del mutágeno ha causado tantas mutaciones que ya no son viables.
♦ Mutantes viables

Los más numerosos suelen ser siempre los no viables, por lo que será necesario ajustar la dosis de mutágeno que se aplica para que quede un porcentaje de viables adecuado. Una vez pasado el tratamiento, se han de hacer crecer las células en medio rico, para incrementar la viabilidad de los mutantes viables, para recuperarlos del tratamiento. Llegados a este punto podemos empezar a aplicar técnicas de enriquecimiento de los mutantes. De todos los mutantes obtenidos se deberá seleccionar el mutante que resulte más ventajoso.

Se pueden obtener muchos tipos de mutantes:

De todos estos, los mutantes auxótrofos pueden ser de los más interesantes, mutantes que necesitan la adición de un metabolito al medio, ya que no pueden sintetizarlo. En estos mutantes la vía de síntesis del metabolito se puede ver afectada, lo que puede implicar la acumulación de productos en esa vía. Si deseamos uno de esos productos tenemos una mayor producción. Otra posibilidad es que, debido a que se forma el nutriente, no se forma otra sustancia, que nosotros deseamos. Si cortamos la posibilidad de que se forme el nutriente, la síntesis se desviará hacia el producto deseado. No obstante se ha de tener en cuenta que no todos los auxótrofos para un metabólitos serán de interés, puesto que dependiendo del enzima afectado puede no formarse el producto deseado.

La detección de mutantes auxotróficos es sencilla, puesto que las bacterias que crezcan en medio rico, pero no en medio mínimo serán auxotróficas. Hasta aquí bien, pero se ha de tener en cuenta, que una vez tengamos estas bacterias, no sabremos para que nutriente son auxótrofas, por lo que deberemos ir haciendo diferentes pruebas hasta identificar el nutriente en cuestión.
Otro punto que se ha de tener en cuenta es que en muchos casos habrá mecanismos de regulación en la bacteria, que no permitirán la acumulación de intermediarios, por lo que lo que nos interesará serán mutantes desregulados, que no tengan regulación, de manera que la acumulación de un producto no interfiera con la síntesis final.
El método para aislar mutantes resistentes a análogos consiste en determinar la concentración inhibitoria del análogo, para después plaquear bacterias tratadas con el agente mutágeno, en medios con concentraciones crecientes de inhibidor. De esta manera, las bacterias que crezcan en estas concentraciones mayores, estarán desreguladas. Las causas de la desregulacións pueden ser:
♦ Se produce una mutación en la regulación de un gen, de manera que debido a una menor síntesis, es menos sensible a la incorporación del análogo.
♦ Puede tener una capacidad disminuida de incorporar el análogo.
♦ ....
Los mutantes resistentes a análogos suelen ser sobreproductores, pero no siempre, porque no están sujetos a regulación por sustrato. Si es auxotrófico puede sobreproducir intermediarios de la vía en lugar del metabolito final.
Una misma ruta metabólica puede tener regulación de diferente complejidad en diferentes cepas bacterianas, de manera que en el momento de producir una determinada sustancia, trabajaremos con el microorganismo que facilite el trabajo.
Al igual que tener el tratamiento mutagénico adecuado, es necesario que tengamos un método preciso para la determinación y aislamiento del mutante. Pero en caso de que no se pueda detectar mediante ninguno de los métodos típicos, de podrán analizar diferentes clones en fermentaciones líquidas para ver cual de ellos sería mejor para la fermentación deseada.