Isómeros ácido l-Ascórbico y Ácido d-iso-Ascórbico Cuantificación en mermeladas de frutas Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia

El ácido ascórbico es un compuesto con importantes características nutricionales. Antiguamente, este compuesto era conocido por su capacidad de prevenir el escorbuto, (1) pero actualmente existe gran interés científico en su capacidad antioxidante y en su funcionalidad nutricional para el organismo humano. (2)

La actividad antioxidante puede actuar capturando radicales libres tóxicos y especies reactivas de oxigeno, previniendo algunas enfermedades y disfunciones en los tejidos y reduciendo el proceso del envejecimiento (3,4) La vitamina C puede actuar en la formación del tejido conjuntivo y en el transporte de iones. (1)

Los casos de toxicidad implicando su ingestión son raros, pues se trata de una vitamina hidrosoluble y es regularmente excretada por el organismo, mientras que dosis excesivas ya se han relacionado con cálculos renales y, en casos más raros, con la anemia causada por la interferencia en la absorción de la vitamina B12. (5)

Más del 90% de la vitamina C presente en la dieta proviene de las frutas y vegetales, (6) principalmente de las frutas cítricas como las naranjas y sus jugos. (7) El tenor puede variar significantemente de acuerdo con las condiciones del cultivo, la época de plantación, la incidencia solar, el nivel de maduración, el manoseo post-colecta y la calidad del suelo. (8) Su uso es frecuente en las industrias alimenticia y farmacéutica, siendo estimado en 154 millones de toneladas en el año 2007. Aproximadamente el 50% de la producción está destinada al agregado en los alimentos, con la intención de prevenir la degradación de los pigmentos, evitar el oscurecimiento enzimático, disminuir las pérdidas del sabor y del aroma, proteger y aumentar los factores nutricionales y aumentar el tiempo de vida en las góndolas. (2)

En medio seco, el ácido ascórbico es estable pero puede degradarse gradualmente en función de la exposición a la luz. (9) Este compuesto en solución es fácilmente oxidado y degradado, siendo el proceso acelerado en presencia del cobre, hierro y álcali. (10)

Debido a la inestabilidad es necesario que las etapas de extracción, detección y cuantificación sean hechas bajo la observación de las condiciones controladas de temperatura y pH, ausencia de oxigeno y metales y presencia de agentes estabilizantes. (8, 11, 12)

Existen varios métodos capaces de determinar ácido ascórbico en muestras. (4) Los métodos biológicos fueron los primeros en ser desarrollados y se basan en la cantidad necesaria para prevenir el escorbuto en conejos de indias. Estos no son frecuentemente más aplicados debido al elevado tiempo de análisis, el alto costo y la baja repetitividad. (9,13) Actualmente los métodos químicos son los más utilizados. (9)

Tilmans, citado por Aldrigue, (9) fue el responsable por desarrollar un método colorimétrico muy empleado hoy en día. Luego de perfeccionamientos, este método fue considerado como patrón para la determinación de jugos y preparados de acuerdo con la Asociación Oficial de Química Analítica (AOAC). (14,15) El método corresponde a una titulación con el indicador 2,6-diclorofenol-indofenol (DCIP) en el cual el ácido ascórbico reduce este reactivo inicialmente azul a una solución incolora. En el punto final de la titulación, el exceso del indicador no reduce o confiere a la solución una coloración rosada, por lo tanto, el punto final puede ser verificado visualmente, sumado a métodos electroquímicos y fotométricos. (9) Esta es una técnica de fácil aplicación y bajo costo, principalmente cuando es comparada con las técnicas cromatográficas, por ejemplo, el uso del DCIP es frecuente tanto para productos alimenticios como para los productos farmacéuticos, siendo aún usado como base de comparación para nuevos métodos.

A pesar de que la AOAC indique este método como oficial, no puede ser aplicado para todas las matrices. Las sustancias presentes naturalmente en las frutas como los taninos, los compuestos sulfidrílicos y metales como el cobre, el hierro y el cobalto son también oxidados por DCIP. (15) Otro impedimento está en el hecho de la coloración natural de las muestras que interfieren en la visualización del punto final.

El ácido ascórbico presenta una estructura con seis carbonos y puede encontrarse en algunas formas isoméricas: ácido L-ascórbico (LAA), ácido D–ascórbico (DAA), ácido L–iso-ascórbico (LIAA) y ácido D–iso-ascórbico (DIAA) (Figura 1). El isómero más encontrado naturalmente en las frutas es el LAA que también es el más utilizado en el organismo para las funciones biológicas. (16) El DIAA también conocido como ácido eritrórbico y ácido D-araboascórbico presenta propiedades antioxidantes similares al LAA pero apenas el 5% de su actividad pro-vitamínica C. Este hecho está asociado a la diferencia estructural en la posición del grupo hidroxilo en el carbono 5. (17-19) El DIAA no se encuentra normalmente en los alimentos naturales, pero presenta gran importancia en la tecnología alimenticia pudiendo ser agregado como en las bebidas, los vinos y la carne, substituyendo a la LAA con lucros económicos sin que la capacidad antioxidante se pierda. (20,21)

Varios métodos que son capaces de cuantificar el ácido ascórbico en alimentos no discriminan entre sus isómeros, lo que genera imprecisión cuando se quiere evaluar la actividad vitamínica C. (9,19) Entre los métodos incapaces de diferenciar el LAA y el DIAA está el indicado por la AOAC. (21,22)

Entre los métodos cromatográficos, la cromatografía en papel y la de capa delgada presentan buenos resultados pero son poco utilizadas. La cromatografía gaseosa muestra buena linealidad y alta especificidad pero involucra etapas de derivación del ácido a trimetilsilil-éter. La cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) es la técnica más utilizada, confiriendo resultados de alta sensibilidad, especificidad y simplicidad, (23,24) empleando columnas de fase reversa y par iónico, la amina ligada, columnas amino poliméricas o más frecuentemente C18. La detección puede ser hecha por la técnica electroquímica, fluorescente o por arreglo de diodos (DAD). (23)

Papa-Louisi y Pascalidou (25) separaron el LAA, el DIAA, el ácido dehidroascórbico (DHA) y el ácido úrico (UA) por CLAE. Usaron el DAD a 323 nm, fase móvil compuesta por 0,38 mg mL-1 de ditiotreitol, tampón fosfato de concentración 5 mmol L-1 y pH 5,0, 2 mmol L-1 de Na2EDTA y 5 mmol L-1 de bromuro de cetiltrimetil amonio.

Este trabajo tuvo como objetivo evaluar un método de identificación y cuantificación de LAA y DIAA en mermeladas de frutas. Verificándose la repetitividad, la linealidad y la recuperación.


Parte Experimental

Reactivos y patrones
El bromuro de hexadecil-trimetil-amonio fue obtenido de Sigma; el fosfato de sodio anhidro, el acetato de sodio y el ácido metafosfórico fueron obtenidos de Merck. El Na2EDTA fue comprado a Reagen. Los patrones de LAA y DIAA al 99 % de pureza fueron obtenidos de Synth (São Paulo, Brasil). El agua desionizada fue producida en el desionizador Milli-Q de Millipore.

Extracción de las muestras
Se utilizaron 10 diferentes muestras de mermelada de fruta: acerola con frutilla, naranja, rosela, acerola y goiaba, acerola y rosela, acerola y maná, acerola y maracuyá, acerola, acerola y banana y, por último, goiaba con rosela. Las mermeladas fueron obtenidas del proveedor Klaus J. G. Bouillon ME. Luego de la recepción, las muestras fueron divididas en pequeñas porciones y almacenadas bajo refrigeración en frascos ámbar. La extracción fue realizada en un tiempo cercano a los análisis para prevenir la degradación.

La extracción fue hecha con alícuotas de 0,5 g de mermelada. La muestra fue diluida y homogeneizada en 50 mL de ácido meta-fosfórico 1% por 3 min. El resultante fue centrifugado por 5 min a 3000 rpm, el sobrenadante fue filtrado en poros de 0,45 μm y aplicado al análisis por CLAE.

Análisis cromatográfica
El sistema cromatográfico consistió en un equipamiento HP Serie 1050 con detector de arreglo de diodos acoplado (DAD).

El tratamiento de los datos fue realizado en el software ChromQuest. La columna empleada fue Waters Spherisolb ODS-2 (250 x 4,6 mm). La fase móvil consistió en 2,3 mmol L-1 de bromuro de hexadecil-trimetil-amonio, 2,5 mmol L-1 de Na₂EDTA, 80 mmol L-1 de fosfato de sodio anhidro y 20 mmol L-1 de acetato de sodio, ajustando a pH 4,5 con ácido ortofosfórico. Fue aplicada una elución isocrática a 0,8 mL min-1. La detección fue realizada a 265 nm.

Validación del método
La selectividad del método fue evaluada utilizándose el DAD a través de la comparación de las respuestas de los compuestos en cuestión presentes en las muestras y también en la solución patrón. Los parámetros de comparación fueron: tiempo de retención, el espectro de absorbancia y la pureza del pico, comparando los espectros en el inicio, en el ápice y en el fin de cada pico. La posible presencia de compuestos no deseados también fue observada. La linealidad del sistema fue verificada por la construcción de una curva analítica con 10 diferentes concentraciones, variando entre 10 y 200 mg L-1. La repetitividad fue medida utilizando 10 replicatas de patrones siendo los patrones evaluados en dos niveles de concentración (30 y 100 mg L-1). La repetitividad también fue verificada analizándose por 10 replicatas la muestra de mermelada con frutilla. Los limites de detección (LD) y de cuantificación (LQ) fueron obtenidos a partir de la curva analítica, a través de la división entre el desvío patrón (s) obtenido en el test de repetitividad y el coeficiente angular de la curva analítica (S) (R=s/S). El LD fue calculado multiplicando R por 3,3 y el LQ fue calculado multiplicando R por 10. (26) El factor de asimetría (As) fue calculado al 10% de la altura de la banda cromatográfica (As = b/a; donde "a" es la banda izquierda y "b" la banda derecha). La resolución de los picos fue calculada en base al tiempo de retención de los picos (tR) y en el ancho de la banda de los mismos (wb) de acuerdo con la ecuación Rs = 2x(tR2 – tR1)/(wb1 + wb2). El factor de separación (α) fue calculado de acuerdo con la ecuación α = (tR2 – tm)/(tR1 – tm) en la cual "tm"es el tiempo muerto. (27)

Tasa de recuperación
La tasa de recuperación (REC) fue obtenida a través del agregado de una concentración conocida del compuesto de interés (Ca) en la muestra antes de la extracción. La tasa fue obtenida por la diferencia entre la concentración del compuesto encontrado en la muestra con la fortificación (Cf) y la muestra sin la fortificación (Ci) de acuerdo con la ecuación REC = (Cf – Ci) x 100/Ca. Fueron realizados agregados en dos niveles de concentración.

Resultados y discusión
Algunos estudios identifican y cuantifican el ácido ascórbico en frutas y jugos (4-7, 9, 15) pero son raros aquellos que tienen productos de elevado grado de procesamiento en foco, como mermeladas de frutas. El ácido ascórbico es muy inestable y en este puede ocurrir una alta degradación durante la fabricación de la mermelada, pues son necesarias etapas como la trituración, la homogeneización y la concentración a elevada temperatura hasta altos niveles de sólidos solubles o el completo tratamiento térmico (pasteurización).(28)

La exposición a la luz, el contacto con el oxígeno y la alta temperatura, pueden degradar el ácido ascórbico.

El procedimiento extractivo fue desarrollado teniendo como base lo indicado como oficial por la AOAC, (14) pero con algunas modificaciones. La primera alteración fue en el solvente: de acuerdo con la AOAC la extracción se realiza con ácido oxálico pero Aldrigue (9) verificó que el ácido meta-fosfórico (MPA) presenta una mayor eficiencia de extracción. Otra ventaja del MPA está en su capacidad de precipitar proteína e inactivar algunas enzimas. (9) En vista de estos hechos, el presente trabajo utilizó MPA al 1% como solvente de extracción.

La homogeneización de la muestra en el MPA fue realizada inicialmente por la agitación manual pero no fue eficiente, pues permanecieron partículas grandes en la solución. Para subsanar esta dificultad, la homogeneización fue hecha en el sonicador por 3 min. Luego de esta etapa el extracto fue centrifugado, filtrado y aplicado al método cromatográfico.

La mejor fase móvil para separar los isómeros fue definida de acuerdo con la revisión bibliográfica (Tabla 1). En esta puede observarse la predominancia de la combinación de un tampón y un par iónico. El detector más utilizado fue el DAD. Apenas un artículo utilizó un antioxidante artificial en la fase móvil. La fase estacionaria más citada fue la de la fase reversa octadecil (C18).

El presente estudio analizó el uso de una solución tampón de fosfato de sodio y el par iónico catiónico bromuro de hexadecil-trimetil-amonio como fase móvil. En la separación cromatográfica, el estado iónico de un compuesto es de fundamental importancia de forma que es esencial el uso de un tampón ácido o base para el control del pH del medio. Esta medida garantiza que el compuesto se mantenga en su estado molecular para la retención en la fase estacionaria. (34) El uso del par iónico en la fase móvil busca modificar dinámicamente la superficie de la fase estacionaria, absorbiendo compuestos iónicos hidrofóbicos, alterando los tiempos de retención. (35) Este es un tipo de cromatografía más complejo pues el equilibrio entre el par iónico y la fase estacionaria es lento, siendo más sensible a las variaciones de la temperatura, el pH y la concentración del par iónico. Debido a este lento equilibrio, la elución por gradiente no es recomendada. (36)

El EDTA posee un alto potencial antioxidante y fue agregado en los análisis para prevenir la degradación de los compuestos. La fase estacionaria empleada fue C18. Luego de los ensayos iniciales, la composición final y el pH del medio fueron establecidos de acuerdo con lo descripto en el ítem "Análisis Cromatográficas".

La validación del sistema fue realizada iniciándose por la selectividad. Como se trata de compuestos isómeros, no hay diferencia entre los espectros de absorción de ambos, por lo tanto, la diferenciación de los compuestos fue realizada apenas por el tiempo de retención.

Cuando las muestras fueron analizadas, los espectros de absorción se mantuvieron semejantes a los patrones en los tiempos de retención determinados, lo que indica pureza de los picos, o sea, ausencia de interferentes en el mismo tiempo de retención de los isómeros. Conforme lo expuesto el método puede ser clasificado como selectivo.

La repetitividad fue testeada utilizándose soluciones de 30 e 100 mg L-1. Durante este procedimiento fue observada una caída en el área de los picos. Esta área es directamente proporcional a la concentración del compuesto, o sea, hubo una degradación del mismo. Las alícuotas fueron preparadas al mismo tempo y aplicadas en el cromatográfico en el transcurso de los análisis. La diferencia fue del 56% entre el primero y el último análisis. Este hecho enfatiza la necesidad de procederse a las extracciones y diluciones tomando algunas precauciones: patrones diluidos, muestras y extractos mantenidos a baja temperatura, en frascos ámbar y bien cerrados hasta que se procediese a la próxima etapa; la extracción fue hecha lo más rápido posible, manteniéndose la regularidad del tiempo entre las diferentes muestras y el extracto de las muestras fue aplicado a la técnica cromatográfica inmediatamente luego de la extracción.

Luego de las modificaciones el desvío patrón relativo quedó debajo del 3%. La separación de los picos puede observarse en la Figura 2. Los picos presentaron una buena separación con resolución de 34,68 y el factor de separación es de 1,21. La resolución evalúa el grado de separación de los picos cromatográficos, siendo considerados los valores de resolución aceptables aquellos encima del 1,5. El factor de separación se calcula utilizando apenas el tiempo de retención corregido siendo que los valores por encima de 1,0 son aceptables. La simetría de los picos también puede ser considerada satisfactoria a la medida que fueron calculados los factores de asimetría debajo de 1,5 (1,2 para el LAA y 1,3 para el IAA). (27) El tiempo de elución del LAA fue de 10,58 ± 0,06 min; el DIAA se eluyó luego de 12,32 ± 0,07 min. Todos los resultados fueron sometidos al test de Grubbs (37) pero ninguno fue rechazado. Estos tiempos de elución indican una buena separación con un valor no muy próximo del inicio de la corrida en el cual generalmente se encuentran muchos picos, pero también no tan largo que perjudicaría el análisis en secuencia.

La linealidad fue verificada construyéndose una curva analítica. Los dos isómeros mostraron buena linealidad en el intervalo evaluado con el coeficiente de correlación encima de 0,99. Los coeficientes linear y angular del LAA fueron respectivamente, 28,5 y -33,7. Los coeficientes para el DIAA fueron 29,6 y -46,2, respectivamente. Para el LAA, los límites de detección y cuantificación calculados fueron 7 y 21 mg L-1, respectivamente. El DIAA presentó 5 mg L-1 para el LD y 14 mg L-1 para el LQ.

En el final de la evaluación el método se mostró selectivo y linear para los dos isómeros; los limites de detección y cuantificación fueron adecuados para las muestras en cuestión, se observó una alta capacidad de detección y cuantificación de estos compuestos en las mermeladas de frutas.

La recuperación del método fue verificada. El LAA y el DIAA fueron agregados en concentraciones de 100 y 50 mg L-1 en todas las muestras. Los valores obtenidos por el estudio de la recuperación quedaron entre el 87 y el 105 %, demostrando ser adecuado para las matrices complejas, conforme la Asociación Nacional de Vigilancia Sanitaria (ANVISA). (38)

Pudo ser cuantificada la cantidad de los isómeros del ácido ascórbico presentes en las mermeladas. El isómero DIAA no fue encontrado en ninguna de las muestras analizadas; apenas fue encontrado el LAA. En la Figura 3 se presenta el cromatograma relativo a la muestra de mermelada de acerola. En la Tabla 2 puede verificar-se la concentración del LAA para cada muestra, conjuntamente con el desvío patrón relativo. La muestra de mermelada de acerola presentó el mayor desvío patrón relativo (3,4%). Por su parte, la muestra de acerola con maracuyá fue la que presentó el menor desvío patrón (1,12%). Estos valores son considerados adecuados quedando bajo el valor máximo aceptable (5%). (38)

Cuantificación de los isómeros ácido L-ascórbico y ácido D-iso-ascórbico
La muestra de mermelada de acerola fue una de las que presentó mayor cantidad de LAA. El compuesto no fue encontrado apenas en la muestra de mermelada de rosela. Una comparación con las cantidades encontradas en la literatura no es posible debido a que los estudios sobre mermeladas son raros y pocos analizan mermeladas con más de una fruta. Una pequeña comparación fue hecha utilizando datos sobre frutas, jugos y pulpas para las mermeladas de acerola y naranja.

Araujo y sus colaboradores (39) encontraron concentraciones entre 1068 y 1836 mg de ácido ascórbico en 100 g de pulpa de acerola congelada. Maia y sus colaboradores (40) encontraron valores entre 573 y 594 mg de ácido ascórbico en 100 mL de jugo de acerola. La mermelada de acerola presentó menor concentración de ácido ascórbico que la pulpa, (39) pero valor próximo al del jugo. (40) Gokmen y sus colaboradores (41) verificaron lo referente al compuesto en algunas frutas, incluyendo la naranja (43,5 mg en 100 g). En la mermelada de naranja el ácido ascórbico fue encontrado en la concentración de 147 mg en 100 g. La producción de mermeladas aplica un mayor grado de procesos degradantes que en las pulpas congeladas o jugos este hecho puede justificar la diferencia entre los resultados.

La ingestión diaria recomendada (IDR) de vitamina C en Brasil y en los Estados Unidos es de 60 mg para un adulto. (42,43) Una porción de mermelada representa 25 mg (una cuchara de sopa). Seis de las mermeladas cuantificadas presentaron cantidades encima de la IDR para una porción. Se necesita una ingestión de un poco más de una porción de las mermeladas de naranja, acerola con banana y goiaba con rosela, para alcanzar la IDR, no necesitando de dos porciones.

Conclusión
El método propuesto y evaluado identificó y cuantificó los isómeros ácido L-ascórbico y ácido D-iso-ascórbico en las mermeladas de frutas. El método demostró ser selectivo, linear, repetitivo y con grado elevado de recuperación. El DIAA no fue encontrado en las muestras. El LAA fue encontrado en las muestra en concentraciones de hasta 605 mg en 100 g de muestras. Seis muestras presentaron valores por encima de la cantidad diaria recomendada, tres mostraron valores por encima de la IDR para hasta dos porciones y el ácido ascórbico no fue encontrado en apenas una mermelada.

Autores
Hernandez Bozardi da Rosa y Renata Cristine Tolotti.
Centro de Ciências da Saúde, Universidade de Caxias do Sul, Rua Francisco Getúlio Vargas, 1130, 95070-560 Caxias do Sul – RS, Brasil.
Diogo dos Santos Miron
Curso de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade de Caxias do Sul, Rua Francisco Getúlio Vargas, 1130, 95070-560 Caxias do Sul – RS, Brasil
Kellen Cristhinia Borges de Souza
Departamento de Ciências Básicas e da Saúde, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Rua Sarmento Leite, 245, 90050-170 Porto Alegre - RS, Brasil

Contacto
e-mail: kellens@ufcspa.edu.br

Referencias
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Fuente: Química Nova, Volumen 35, Nº. 5, 1030-1035, 2012.