Clases de Antibióticos Su determinación por LC/MS/MS en aguas con preparación en línea de la muestra
Introducción
Existe una creciente preocupación por la presencia de antibióticos en fuentes ambientales de agua. Esto ha hecho que laboratorios ambientales y gubernamentales desarrollen metodologías por LC-MS para monitorear estos compuestos en fuentes de provisión de agua.1-4 Las muy bajas concentraciones de los antibióticos en estas matrices normalmente requieren un gran trabajo de pre-concentración y limpieza de la muestra. La preparación de las muestras de agua (100 a 1000 ml) antes del análisis LC/MS/MS lleva bastante tiempo reduciendo así la productividad (usualmente el número de muestras es alto).
Se describe aquí una metodología que reduce significantemente el tiempo de preparación de la muestra por uso de pre-concentración y extracción en línea acoplada a un detector triple cuadrupolo (TSQ Quantum de Thermo Scientific) operando en el modo de monitoreo de reacción de fragmentación altamente selectiva (H-SRM) para la determinación de antibióticos a muy bajos niveles de concentración (pg/ml).
Se describe aquí una metodología que reduce significantemente el tiempo de preparación de la muestra por uso de pre-concentración y extracción en línea acoplada a un detector triple cuadrupolo (TSQ Quantum de Thermo Scientific) operando en el modo de monitoreo de reacción de fragmentación altamente selectiva (H-SRM) para la determinación de antibióticos a muy bajos niveles de concentración (pg/ml).
Experimental
Los antibióticos ensayados (Tabla 1) fueron provistos por Sigma y utilizados sin purificación adicional. Las soluciones madre de los estándares de antibióticos (1,0 mg/ml) se prepararon en metanol y se almacenaron en viales de polipropileno color ámbar a -20 ºC. A las muestras de agua se les adicionó Na2EDTA (2 µg/ml en H2O) para inhibir la interacción de las tetraciclinas con las superficies de vidrio y los iones metálicos en solución.1 El sistema en línea de Thermo Scientific para concentración/extracción (Aria TLX-2) se basa en la tecnología TurboFlow® cuyo elemento clave es la columna. Volúmenes de 1 ml de muestras de agua fueron inyectadas sin preparación adicional de las mismas. Los antibióticos seleccionados fueron enfocados y, desde luego concentrados en la columna de extracción de flujo turbulento, para luego ser transferidos a la columna analítica. La separación se llevó a cabo con un gradiente de fase reversa previo a la detección con el TSQ Quantum en el modo de monitoreo de reacción de fragmentación altamente selectiva (H-SRM).
Extracción TurboFlow:
Cromatografía Líquida:
Resultados y Discusión
Detalles del método empleado
Los 13 antibióticos ensayados (Tabla 1) fueron pre-concentrados en una columna de extracción TurboFlow de modo mixto Cyclone MAX que posee características de fase reversa y de intercambio aniónico. Luego de la inyección de la muestra utilizando un flujo en la columna TurboFlow de 2 ml/min para remover interferencias de la matriz (ver figura inicial), la válvula 1 se conmuta para permitir que el solvente de extracción (50% acetonitrilo + ácido fórmico 0,1%) transfiera los analitos a la columna analítica. El alto contenido orgánico del solvente de extracción se diluye por la fase móvil altamente acuosa de la bomba de elución a 1,2 ml/min. Este mezclado dinámico sucede antes de la columna analítica de modo que los antibióticos pueden reenfocarse antes de la etapa de separación por fase reversa. La columna TurboFlow es reacondicionada durante la adquisición de datos para la próxima inyección.
La adquisición de datos en el triple cuadrupolo, tanto en modo de transición de alta resolución (H-SRM) o unitaria (SRM) fue llevada a cabo en 5 segmentos monitoreando 8 transiciones en cada uno de ellos. El hecho de monitorear dos transiciones por antibiótico no sólo obedece a un propósito confirmatorio sino además en mejorar la estadística iónica. El empleo de alta resolución en el primer cuadrupolo aumenta tanto la selectividad como la sensibilidad de la metodología al disminuir el "ancho" del rango de masas que filtra este primer elemento (en resolución unitaria se permite que masas con diferencias de hasta 1 uma se transfieran a la celda de colisión).
En este trabajo se está utilizando el sistema Aria-TLX-2 en el que, a efectos de mayor productividad, se utilizan dos conjuntos de "extracción TurboFlow + cromatografía líquida" acoplados a un único detector triple cuadrupolo operando a través del software Aria que permite consolidar el sistema haciendo que las columnas analíticas eluyan al detector sólo durante la porción significativa de la corrida y permitiendo así la superposición de corridas. De este modo se consiguen realizar dos corridas en el tiempo que normalmente tardaría sólo una.
Sensibilidad y calibración:
La figura 2 presenta los cromatogramas de los estándares de los 13 antibióticos y la dehidroeritromicina en sus límites de cuantificación (entre 0,5 y 5 pg/ml) inyectando 1 ml de muestra. Las calibraciones se generaron desde los límites de cuantificación hasta 100 pg/ml para los 13 antibióticos en agua desionizada. 13 de los 11 antibióticos observaron curvas de calibración lineales (con ponderación 1/x, siendo x la concentración). Sulfametoxazol y sulfametizol dieron mejores resultados utilizando un ajuste cuadrático. En todos los casos: R2 ≥ 0,990 (4 replicados).
Fortalecimiento de antibióticos en una muestra de agua de superficie:
La figura 3 muestra los resultados obtenidos para una muestra de agua de superficie fortalecida a nivel de 25 pg/ml con los estándares. Previo al fortalecimiento, la muestra de agua fue monitoreada utilizando el método descripto y se observó la no presencia de los antibióticos. La figura 4 muestra un ensayo comparativo con muestras puras de antibióticos a 25 pg/ml. Las sulfonamidas mostraron una menor supresión iónica mientras los macrólidos presentaron una señal levemente aumentada. Las tetraciclinas sin embargo mostraron una diferencia significante en la respuesta que podría atribuirse a la interacción de estos compuestos con metales residuales en el agua.
Monitoreo de antibióticos en muestras ambientales:
Se monitorearon antibióticos en muestras de aguas de superficie de distintos lugares de California, Florida y Ontario utilizando la metodología descripta. De todas ellas sólo la del Lago Ontario mostró un nivel significante (figura 5). Los insertos en la figura 5 muestran las trazas cromatográficas para las dos transiciones correspondientes a los antibióticos encontrados.
Conclusiones:
Se ha podido demostrar la utilidad de un método LC-MS/MS con limpieza y pre-concentración de la muestra en línea para la determinación de antibióticos en muestras de aguas a niveles de pg/ml. La capacidad de trabajar con grandes volúmenes (1 ml) por parte de la tecnología de extracción de flujo turbulento reduce significativamente el tiempo de análisis de horas a minutos. El uso de detección con un triple cuadrupolo de alta resolución capaz de llevar a cabo transiciones con alta selectividad, provee una clara ventaja en relación a la selectividad y confianza de análisis con respecto a los análisis realizados en condiciones de resolución unitaria (0,7 Da FWHM). Alta productividad no sólo se logra por el empleo de metodología de preparación de la muestra en línea sino además por el empleo de una configuración instrumental que permite acoplar dos sistemas cromatográficos a un mismo detector triple cuadrupolo.
Referencias:
1 Lindsey, M. E.; Meyer, M.; Thurman, E. M.; Anal.Chem., 2001, 73,4640-4646.
2 Yang, S.; Cha, J.; Carlson, K.; Rapid Commun. Mass Spectrom., 2004, 18, 2131-2145.
3 Gobel, A.; McArdell, C. S.; Suter, M. J.-F.; Giger, W.; Anal. Chem., 2004, 76, 4756-4764.
4 Shang, D.; Dyck, M.; Jia, X.; DiCicco, A.; Alleyne, C.; Nicolidakis, H.; Mori, B.; Proc. 48th ASMS Conf. on Mass Spectrom. And Allied Topics, TPH #264.
Los antibióticos ensayados (Tabla 1) fueron provistos por Sigma y utilizados sin purificación adicional. Las soluciones madre de los estándares de antibióticos (1,0 mg/ml) se prepararon en metanol y se almacenaron en viales de polipropileno color ámbar a -20 ºC. A las muestras de agua se les adicionó Na2EDTA (2 µg/ml en H2O) para inhibir la interacción de las tetraciclinas con las superficies de vidrio y los iones metálicos en solución.1 El sistema en línea de Thermo Scientific para concentración/extracción (Aria TLX-2) se basa en la tecnología TurboFlow® cuyo elemento clave es la columna. Volúmenes de 1 ml de muestras de agua fueron inyectadas sin preparación adicional de las mismas. Los antibióticos seleccionados fueron enfocados y, desde luego concentrados en la columna de extracción de flujo turbulento, para luego ser transferidos a la columna analítica. La separación se llevó a cabo con un gradiente de fase reversa previo a la detección con el TSQ Quantum en el modo de monitoreo de reacción de fragmentación altamente selectiva (H-SRM).
Extracción TurboFlow:
- Columnas TurboFlow: Cyclone® MAX 0,5 mm x 50 mm
- Volumen de inyección: 1 ml
- Flujo: 2,0 ml/min
- Fase móvil de las bombas de carga: A) bicarbonato de amonio 10 mM, B) ácido acético 0,5 % + ácido trifluoracético 0,04 %, C) acetonitrilo + ácido fórmico 0,1%
Cromatografía Líquida:
- Columnas analíticas: Thermo Scientific Hypersil GOLD 4,6 mm x 100 mm, 3µm
- Flujo: 1,2 ml/min
- Fase móvil de las bombas de elución: A) ácido acético 0,5 % + 0,04 % ácido trifluoracético; B) acetonitrilo + ácido acético 0,5 % + 0,04 % ácido trifluoracético
- División de flujo: post-columna, 0,5 ml/min a la sonda de electrospray
- Modo de ionización: electrospray positivo
- Temperatura del tubo de transferencia: 375 oC
- Presión del Q2: 1,5 mTorr de Argón
- Transiciones: se indican en la Tabla 1
- Tiempo de cada transición: 40 ms
- Resolución del Q1: 0,7 Da FWHM (unitaria) o 0,15 Da FWHM
- Resolución del Q3: 0,7 Da FWHM (unitaria)
Resultados y Discusión
Detalles del método empleado
Los 13 antibióticos ensayados (Tabla 1) fueron pre-concentrados en una columna de extracción TurboFlow de modo mixto Cyclone MAX que posee características de fase reversa y de intercambio aniónico. Luego de la inyección de la muestra utilizando un flujo en la columna TurboFlow de 2 ml/min para remover interferencias de la matriz (ver figura inicial), la válvula 1 se conmuta para permitir que el solvente de extracción (50% acetonitrilo + ácido fórmico 0,1%) transfiera los analitos a la columna analítica. El alto contenido orgánico del solvente de extracción se diluye por la fase móvil altamente acuosa de la bomba de elución a 1,2 ml/min. Este mezclado dinámico sucede antes de la columna analítica de modo que los antibióticos pueden reenfocarse antes de la etapa de separación por fase reversa. La columna TurboFlow es reacondicionada durante la adquisición de datos para la próxima inyección.
La adquisición de datos en el triple cuadrupolo, tanto en modo de transición de alta resolución (H-SRM) o unitaria (SRM) fue llevada a cabo en 5 segmentos monitoreando 8 transiciones en cada uno de ellos. El hecho de monitorear dos transiciones por antibiótico no sólo obedece a un propósito confirmatorio sino además en mejorar la estadística iónica. El empleo de alta resolución en el primer cuadrupolo aumenta tanto la selectividad como la sensibilidad de la metodología al disminuir el "ancho" del rango de masas que filtra este primer elemento (en resolución unitaria se permite que masas con diferencias de hasta 1 uma se transfieran a la celda de colisión).
En este trabajo se está utilizando el sistema Aria-TLX-2 en el que, a efectos de mayor productividad, se utilizan dos conjuntos de "extracción TurboFlow + cromatografía líquida" acoplados a un único detector triple cuadrupolo operando a través del software Aria que permite consolidar el sistema haciendo que las columnas analíticas eluyan al detector sólo durante la porción significativa de la corrida y permitiendo así la superposición de corridas. De este modo se consiguen realizar dos corridas en el tiempo que normalmente tardaría sólo una.
Sensibilidad y calibración:
La figura 2 presenta los cromatogramas de los estándares de los 13 antibióticos y la dehidroeritromicina en sus límites de cuantificación (entre 0,5 y 5 pg/ml) inyectando 1 ml de muestra. Las calibraciones se generaron desde los límites de cuantificación hasta 100 pg/ml para los 13 antibióticos en agua desionizada. 13 de los 11 antibióticos observaron curvas de calibración lineales (con ponderación 1/x, siendo x la concentración). Sulfametoxazol y sulfametizol dieron mejores resultados utilizando un ajuste cuadrático. En todos los casos: R2 ≥ 0,990 (4 replicados).
Fortalecimiento de antibióticos en una muestra de agua de superficie:
La figura 3 muestra los resultados obtenidos para una muestra de agua de superficie fortalecida a nivel de 25 pg/ml con los estándares. Previo al fortalecimiento, la muestra de agua fue monitoreada utilizando el método descripto y se observó la no presencia de los antibióticos. La figura 4 muestra un ensayo comparativo con muestras puras de antibióticos a 25 pg/ml. Las sulfonamidas mostraron una menor supresión iónica mientras los macrólidos presentaron una señal levemente aumentada. Las tetraciclinas sin embargo mostraron una diferencia significante en la respuesta que podría atribuirse a la interacción de estos compuestos con metales residuales en el agua.
Monitoreo de antibióticos en muestras ambientales:
Se monitorearon antibióticos en muestras de aguas de superficie de distintos lugares de California, Florida y Ontario utilizando la metodología descripta. De todas ellas sólo la del Lago Ontario mostró un nivel significante (figura 5). Los insertos en la figura 5 muestran las trazas cromatográficas para las dos transiciones correspondientes a los antibióticos encontrados.
Conclusiones:
Se ha podido demostrar la utilidad de un método LC-MS/MS con limpieza y pre-concentración de la muestra en línea para la determinación de antibióticos en muestras de aguas a niveles de pg/ml. La capacidad de trabajar con grandes volúmenes (1 ml) por parte de la tecnología de extracción de flujo turbulento reduce significativamente el tiempo de análisis de horas a minutos. El uso de detección con un triple cuadrupolo de alta resolución capaz de llevar a cabo transiciones con alta selectividad, provee una clara ventaja en relación a la selectividad y confianza de análisis con respecto a los análisis realizados en condiciones de resolución unitaria (0,7 Da FWHM). Alta productividad no sólo se logra por el empleo de metodología de preparación de la muestra en línea sino además por el empleo de una configuración instrumental que permite acoplar dos sistemas cromatográficos a un mismo detector triple cuadrupolo.
Referencias:
1 Lindsey, M. E.; Meyer, M.; Thurman, E. M.; Anal.Chem., 2001, 73,4640-4646.
2 Yang, S.; Cha, J.; Carlson, K.; Rapid Commun. Mass Spectrom., 2004, 18, 2131-2145.
3 Gobel, A.; McArdell, C. S.; Suter, M. J.-F.; Giger, W.; Anal. Chem., 2004, 76, 4756-4764.
4 Shang, D.; Dyck, M.; Jia, X.; DiCicco, A.; Alleyne, C.; Nicolidakis, H.; Mori, B.; Proc. 48th ASMS Conf. on Mass Spectrom. And Allied Topics, TPH #264.
Esta nota ha sido elaborada por:
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Tel.: 4705-0865
emagrini@sol-analiticas.com
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