Análisis Microbiológico de Alimentos Microbiología Alimentaria - Parte VI Hector Massaguer

Queremos cuantificar los microorganismos, así como identificarlos. Esto no parece tener mucho problema, pero se ha de considerar que en la industria se trabajará en el control de atmósferas y superficies. Las dos pueden ser focos de contaminación a tener en cuenta.

Se conoce como punto crítico de control a aquél punto en que si no se ejerce el control adecuado, se alterará el sistema. Tanto la atmósfera como las superficies son puntos críticos de control. No existe una flora autóctona de las superficies o de la atmósfera. Son bacterias que están en tránsito. Serán bacterias que estarán muy dañadas, por los procesos que se puedan haber hecho para esterilizar la atmósfera o la superficie, por lo que para identificarlos deberé revivificarlos. De hecho, siempre se efectuará un recuento aproximado, debido a que habrá organismos muy lesionados que no podrán revivificarse.

El control del aire es cada vez más importante para muchas industrias diferentes, desde la farmacéutica a la electrónica, pasando por la alimentaria. Un aire estará muy limpio cuando en él haya menos de 10 microorganismos por metro cúbico. A través del aire se pueden vehiculizar posibles factores de enfermedades. Existen diferentes métodos para medir la cantidad de organismos en el aire. Por un lado está el sistema de placa abierta. En este método dejas una serie de placas abiertas con diferentes medios, durante un tiempo determinado, en diferentes lugares. Mediante este método podemos ver la presencia de organismos, pero no podemos cuantificar. Otro método usado es el que consiste en el uso de colectores de aire, mediante sistemas que aspiren el aire, proyectándolo después de manera tangencial sobre las placas de Petri, a una determinada velocidad. Mediante este método sí se pueden cuantificar los organismos del volumen de aire.

Al hacer controles de aire se establecen protocolos de muestreo. El análisis es importante, pero si descansa en un muestreo no válido, no servirá de nada. Se han de hacer planes de muestreos previos a la toma de muestras, de manera que no quede nada al azar Se han de controlar todos los posibles espacios en una habitación.

El control de superficies es necesario porque a menudo ocurren problemas de limpieza, desinfección, esterilización de superficies,... Ha de haber protocolos que permitan saber si el proceso ha funcionado y una superficie es estéril. EL método más usual de los que se emplean, el normalizado, es el uso de las placas RODAC, Replicate Organism Direct Agar Contact. Consiste en llenar la placa de medio y después poner la placa con el medio sobre la superficie, arrastrando los organismos. Es el método más fácil de hacer. Además. dada su forma rectangular, permite el control de medios líquidos por inmersión. Otro método usado es el de los escobillones, “SWAB”. Se pasa el escobillón por la superficie y después se pasa a la placa de Petri, de manera que las bacterias crecerán en ésta. El problema es que siempre se ha de hacer igual para que sea válido. Si en lugar de ser algodón se trata de alginato se pueden hacer análisis totalmente cuantitativos. De hecho es válida cualquier idea que se pueda tener, con el único requisito de que SIEMPRE se ha de usar el mismo protocolo.

Otro método se basa en la presencia de ATP o en su ausencia. En una superficie limpia ha de haber ATP, ya que si lo hay, no estará limpia. Usamos el complejo luciferin luciferasa, que en presencia de ATP provoca luz. Se trata de un medio muy fiable. Además, se puede detectar la cantidad de ATP por la cantidad de luz. Las ventajas que tiene este sistema son que es rápido, en unos 10’, y que tiene una elevada sensibilidad, que permite detectar ng de ATP, hasta puede detectar 300 bacterias.

Si nos centramos en el análisis de alimentos, hemos de considerar que el muestreo debe ser siempre significativo y representativo, para lo que están los estadísticos. A través de diferentes herramientas podrán llegar a elaborar un plan de muestreo que deberá seguir. Determinados productos podrán ser más sensibles que otros productos, por lo que deberán ser controlados más a menudo. La importancia del muestreo depende de la importancia sanitaria, del consumo del alimento y de una cierta estacionalidad.

Siempre se ha de tener en cuenta que el muestreo es tan importante como el propio análisis. La contaminación se da al azar en el alimento y en los lotes de distribución, por lo que se deberá homogeneizar la muestra. Todo esto debe estar previsto en los planes de muestreo.

Cuando el alimento es fresco, el análisis debe hacerse enseguida, pero no debe hacerse en el laboratorio, que puede durar días y días, sino que debe hacerse a tiempo real, como mucho en una jornada de trabajo, ya que no se puede retener un producto fresco, ya que provoca pérdidas. En el caso de las conservas y semiconservas el proceso no ha de ser tan rápido. Parte las muestras las analizas, mientras que las otras las almacenas entre 37 y 42º C semanas o días respectivamente. Se provoca un envejecimiento artificial del producto.

El análisis microbiológico tiene 2 aspectos, la cuantificación y la identificación. Se valoran especialmente los procesos a tiempo real y los automatizados, ya que a través de la rutina se puede provocar el tedio y la monotonía en el operario, induciéndole a error. Además, si es un trabajo rutinario, se podrá hacer una máquina que lo haga.

Métodos de cuantificación
A. Directa
Da un número exacto. El problema es que hasta hace poco tiempo los mecanismos usados eran 1, tan solo el recuento manual, que presentaba dos grandes defectos, por un lado la fatiga del operario, que podía provocar errores, y la baja cantidad de análisis por unidad de análisis que se podían hacer. Actualmente hay máquinas que se facilitan esto. La platina se mueve sola en las máquinas, facilitando el trabajo de los operarios. Además, el uso de cámaras de video unidas a microscopios, unidos a su vez a programas informáticos complejos de recuento permite acelerar el proceso. Adicionalmente, mediante el uso de marcajes, como puede ser epifluorescencia.

De manera que gracias a todo esto los recuentos directos están volviendo a usarse, porque son rápidos y la electrónica los facilita mucho.

1. Existen máquinas de análisis de imagen, que permiten con tan solo 1 ml de muestra y 1 ml de medio, en 6 horas tener resultados. Se pasa la muestra en forma de portaobjetos. La máquina buscará colonias no visibles al ojo humano, pero si observables con microscopio. No es necesario esperar tanto como en las placas normales.
   
2. Mediante la citometría de flujo se pueden medir y contar componentes celulares y las propias células en suspensión líquida. La esencia del sistema consiste en que las células en suspensión son llevadas 1 a 1 a través de un canal de flujo. Diferentes dispositivos del aparato permiten regular la trayectoria y la velocidad a la que pasan las células por el conducto. Según los sensores de que dispongamos podremos medir diferentes propiedades de las células en suspensión, como puede ser fluorescencia, absorbancia, dispersión,... En base a estas características pueden ser divididas en grupos. Además, se puede combinar con la tinción de las células, con lo que se tendrán más combinaciones.
3. Recuento de UFC. Es un método de recuento directo que se basa en el supuesto de que cada célula formará una colonia en la placa. Basta contar las colonias de la placa para saber el número total de bacterias. La calidad de las placas es básica para la eficacia del recuento, ya que podrán tener diferente volumen,... Además, debido a que será necesario hacer mucho medio será necesario desarrollar máquinas dispensadoras.
   En cualquier caso será necesario comparar los diferentes medios. Para hacer esto se hacen los tests ecométricos. Dado que existen diferentes componentes de medios, hemos de considerar cual es el mejor. Estos tests funcionan como sigue. Se seleccionan 3 cepas que sean fáciles de recuperar en ese medio y 3 cepas más que resulten inhibida por ese medio. Se siembran 21 estrías por placa, 4 grupos de 5 y una central. Después contaremos la cantidad de grupos en los que ha habido crecimiento por placa, de manera que un medio ideal debería ser 5,5,5,0,0,0, pero de hecho normalmente son 5,3,5,2,1,0 o similar.
   El método de las UFC presenta un gran inconveniente, que es la excesiva intervención del operario, ya que este hace diluciones, extensiones y recuentos. Es demasiado trabajo monótono para una persona, de manera que existe un método normalizado. Se trata del método de siembra en espiral en placa. Se trata de una máquina que distribuye el inóculo líquido en la superficie de una placa en rotación con el medio adecuado. El brazo dispensador se mueve desde el centro de la placa hacia el exterior, depositando la muestra en espiral la cánula asociada al brazo va dejando ir un volumen decreciente de muestra, de manera que en una sola placa desciende el orden de magnitud hasta en 4 grados. El recuento se hace usando una plantilla especial, junto con una máquina, normalmente equipada con láser para el recuento. Es un método totalmente automatizado, el hombre no interviene.
   
4. Método del Número Más Probable (NMP). Se trata de un método estadístico para averiguar el número de organismos. Se basa en la presunción de que independientemente del número de organismos que haya en la muestra, pasado un cierto tiempo, si están los organismos que creemos, la prueba deberá ser positiva. Las tablas que se usan se elaboran mediante programas informáticos. De nuevo encontramos el problema de la mano humana en este proceso, añadiéndole el hecho de que pueden ser necesarias réplicas para ir sobre seguro, de manera que hará falta mucho material. La técnica del NMP puede ser más precisa incluso que la de recuento de UFC. Se ha de tener en cuenta siempre que todos los tubos del NMP no pueden ser positivos, ya que en ese caso se debe volver a empezar, pero con una dilución mayor a la empleada. Se han desarrollado blisters que permiten usar el NMP.
   
5. Fluorógenos y cromógenos. La cuestión es que observando los microorganismos se ha observado que determinadas géneros, especies o cepas tienen actividades enzimáticas características. Elaboraremos entonces sustratos fluorógenos o cromógenos, de manera que la actividad del enzima sobre estos provoque el desprendimiento de esta sustancia, de manera que dará color. Se usarán uno u otro tipo según gustos. Uno de los fluorógenos más usados es el MUG, 4-metil-umbelifenil-β-D-glucurónido. Detecta la actividad de la β-D-glucuronidasa. Casi todas las E.coli tienen esta actividad, y prácticamente ninguna otra bacteria. Estas sustancias se añaden a los medios de crecimiento de la bacteria a detectar.

B. Indirecta
Necesitas encontrar sustancias o actividades que estén relacionadas con la cantidad de microorganismos. En la industria alimentaria uno de los métodos usados más frecuentemente es el de la impedancia. Los métodos indirectos no tienen la misma precisión que los directos, pero son más rápidos en muchos casos, y están más automatizados.

• Impedancia. Se basa en tomar una medida eléctrica relacionada con la resistividad o la conductividad del medio. Un medio estéril tendrá la misma impedancia en todo momento, mientras se mantenga estéril. Pero con la presencia de microorganismos, se gastarán nutrientes y se producirán metabolitos, con lo que se modificará la resistividad. El parámetro de tiempo de detección de cambio de impedancia está relacionado con la cantidad de microorganismos en el medio. Hemos de encontrar una relación entre UFC e impedancia, para poder así calibrar el aparato que mide la impedancia. Para poder hacer esto usaremos patrones conocidos.

Ver también: Parte I | Parte II | Parte III | Parte IV | Parte V |