Determinación de Antibióticos Aminoglicósidos en carne y leche por UPLC/MS/MS
Análisis de Residuos en Alimentos de Origen Animal
Introducción
El uso de antibióticos aminoglicósidos usados en la medicina veterinaria para el tratamiento de animales criados para la nutrición y producción de leche, requiere de un método efectivo para el análisis de residuos. Esta clase de antibióticos presenta desafíos significativos en el análisis de residuos, ya que muchos de ellos no son de extracción simple de los tejidos y la leche por medio de acetonitrilo u otros solventes orgánicos. En este estudio, los aminoglicósidos se extraen del tejido o leche usando un buffer acuoso con ácido tricloroacético (TCA), el cual se agrega para precipitar las proteínas e inhibir la unión de éstas al analito. Luego y antes del análisis por LC/MS se emplea un procedimiento de cleanup para eliminar el TCA residual y minimizar las interferencias de eventuales compuestos coextraídos.
El uso de antibióticos aminoglicósidos usados en la medicina veterinaria para el tratamiento de animales criados para la nutrición y producción de leche, requiere de un método efectivo para el análisis de residuos. Esta clase de antibióticos presenta desafíos significativos en el análisis de residuos, ya que muchos de ellos no son de extracción simple de los tejidos y la leche por medio de acetonitrilo u otros solventes orgánicos. En este estudio, los aminoglicósidos se extraen del tejido o leche usando un buffer acuoso con ácido tricloroacético (TCA), el cual se agrega para precipitar las proteínas e inhibir la unión de éstas al analito. Luego y antes del análisis por LC/MS se emplea un procedimiento de cleanup para eliminar el TCA residual y minimizar las interferencias de eventuales compuestos coextraídos.
Los cartuchos Oasis HLB para SPE, una fase reversa de alto rendimiento y humectable con agua, permiten una eficiente depuración y una buena recuperación a partir de leche y carne bovina. Con posterioridad, las columnas ACQUITY UPLC HSS PFP usadas en modo de fase reversa con apareamiento iónico permitieron obtener excelentes resultados con el uso de ácido heptafluorbutírico (HFBA) como ión de apareamiento. Este reactivo es volátil y compatible con la espectrometría de masa.
Los Niveles Máximos Mundialmente aceptados (MRLs por sus siglas en inglés) para los residuos de antibióticos aminoglicósidos, están entre los 100 y 1000 μg/kg de leche como puede verse en la Figura 1.
Esta aplicación presenta la metodología apropiada para la determinación a nivel de ppb de antibióticos aminoglicósidos en leche y tejidos bovinos y fue desarrollada en parte de los métodos presentados en las Referencias 1 y 2.
Materiales y Métodos
Condiciones UPLC
Sistema: ACQUITY UPLC
Columna: ACQUITY HSS PFP 2.1 x 100 mm, 1.7 μm (P/N 186005967)
Volumen de inyección: 30 μL
Temperatura: 35 °C
Fase móvil A: 20 mM HFBA en agua
Fase móvil B: 20 mM HFBA en acetonitrilo
Caudal: 50 mL/min
Gradiente: Lineal, 20% a 80% B en 7 min, 80% B hasta 8 min, retorno a 20% B a 8.1 min. Mantenimiento y reequilibrio por 10 min.
Condiciones MS
Espectrómetro de masa: ACQUITY TQD
Modo: Electrospray positivo (ES+)
Capilar: 3.0 kV
Extractor: 3.0 V
Temperatura de fuente: 130 °C
Gas de cono: 20 L/h
Temperatura de desolvatación: 450 °C
Gas de desolvatación: 900 L/h
Gas de colisión: argón 0.20 mL/min
Preparación de la muestra
Buffer de extracción (NH4Ac 10 mM - Na2EDTA 0.4 mM - NaCl 1% - TCA 2%):
Colocar 0.77 g de acetato de amonio en un matraz de 1L, agregar unos 900 mL de agua y disolver. Ajustar el pH a 4.0 con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio 1 N. Agregar 0.15 g de etilendiaminotetraacetato de sodio (Na2EDTA.2H2O), 5 g de cloruro de sodio y 20 g de ácido tricloroacético (TCA). Mezclar bien para disolver y completar con agua.
Extracción inicial
Llevar 2 g de tejido bovino homogeneizado o 10 mL de leche a un tubo de centrífuga de 50 mL. Agregar 20 mL de buffer de extracción y mezclar a modo vórtice por 10 segundos. Agitar bien por 1 minutos, centrifugar a 4000 RPM por 5 minutos y recolectar el sobrenadante. Ajustar el pH del sobrenadante a 6.5±0.5 usando HCl o NaOH diluido según sea necesario.
Cleanup SPE
En este estudio se utilizaron placas Oasis HLB DE 30 mg. En caso de preferir cartuchos individuales, pueden usarse cartuchos de 1 cm3- 30 mg. Los cartuchos o pozos de la placa se acondicionan con 1.5 mL de metanol, seguidos por 1.5 mL de agua. El caudal deberá estar en 1 mL/min o menos. Luego se carga el sobrenadante obtenido de la extracción inicial, ajustados en pH. Se utiliza una alícuota de 1 mL de muestra de tejidos o 1.5 mL de la muestra de leche. Se lava con 1 mL de agua y se eluye con 0.5 mL de una mezcla de ácido fórmico-isopropanol-agua (10:5:85). Se agrega 1.5 μL de HFBA y se analiza usando UPLC/MS/MS.
Resultados y discusión
La Figura 2 muestra un cromatograma UPLC/MS/MS obtenido por análisis de una muestra de leche bovina enriquecida. Las mismas condiciones se usan para muestras de músculo bovino. Los resultados obtenidos en muestras enriquecidas se muestran en la Tabla 2 (leche) y Tabla 3 (tejido muscular). La neomicina (B y C) y gentamicina (C2a y C2) existen como una mezcla de isómeros isobáricos y son parcialmente resueltos. Para la cuantificación se utiliza la suma del área de los pares de picos.
La recuperación se determinó comparando el área de picos MRM en muestras de matriz con y sin enriquecimiento con antibióticos, previamente a la preparación de la muestra.
El efecto matriz fue inferior al 30% para carnes y menor de 12% para leche.
Contrariamente a otros antibióticos usados en medicina veterinaria, los aminoglicósidos no pueden extraerse de los tejidos animales y muestras relacionadas usando solventes orgánicos. Sin embargo, estos compuestos pueden extraerse eficientemente usando buffers acuosos. Esta extracción incluye el uso de un agente (TCA) para facilitar la precipitación de proteínas.
El uso de un eluyente de bajo contenido orgánico en el protocolo de Oasis HLB SPE resultó en un cleanup mejorado como alternativa a la elución con metanol (el uso de ácido fórmico-metanol como eluyente, derivó en la absorción de mayor cantidad en el cartucho, luego de la elución de aminoglicósidos).
Como modo separativo se escogió la fase reversa con apareamiento iónico en UPLC. El mejor compromiso entre la geometría de pico y la sensibilidad se obtuvo usando 20 mM de ácido heptafluorbutírico como agente de apareamiento. También se evaluó el uso de UPLC con columnas HILIC, pero la morfología de los picos resultó mucho más favorable utilizando el método finalmente propuesto. Adicionalmente, una desventaja del modo "HILIC mode" es que si el diluyente estándar y muestras hubiera sido acetonitrilo y el protocolo optimizado SPE, utiliza una muestra acuosa más apropiada para el análisis en fase reversa.
Conclusiones
La columna analítica ACQUITY UPLC HSS PFP de UPLC mostró un excelente desempeño en modo fase reversa con apareamiento iónico.
El ácido heptafluorbutírico (HFBA) fue un agente de apareamiento efectivo en el análisis por RP-IPC en UPLC.
Se presenta como un procedimiento simple y rápido para la extracción de antibióticos aminoglicósidos en carne y leche bovina. Un operador puede analizar fácilmente unas 20 muestras por día.
Se presenta como un protocolo optimizado SPE, usando una placa Oasis HLB de 96 pocillos.
Puede demostrarse un LOQ = 10 ppb en leche bovina y 50 ppb en músculo bovino, con relación a la señal a ruido mayor que 100:1 para todos los analitos en esos niveles.
Referencias
1. Michael S. Young, Kim van Tran, Evelyn Goh, and Jeremy C. Shia Waters Corporation, Milford, MA, USA.
2. Screening and Confirmation for Aminoglycosides by UHPLC-MS-MS (United States Department of Gariculture Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science).
3. Plozza T, Trenerry VC, Zeglinski P, Nguyen H, Johnstone P. The Confirmation and Quantification of Selected Aminoglycoside Residues in Animal Tissue and Bovine Milkby Liquid Chromatography Tandem MassS pectrometry. International Food and Research Journal. 2011; 18 (3): 1077-1084.
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D´AMICO Sistemas S.A.
Distribuidor exclusivo Quantachrome Instruments en Argentina
Paracas 51 (C1275AFA) Buenos Aires
Tel.: (54 11) 4306-0920 (líneas rotativas)
ventas@damicosistemas.com
www.damicosistemas.com
Los Niveles Máximos Mundialmente aceptados (MRLs por sus siglas en inglés) para los residuos de antibióticos aminoglicósidos, están entre los 100 y 1000 μg/kg de leche como puede verse en la Figura 1.
Esta aplicación presenta la metodología apropiada para la determinación a nivel de ppb de antibióticos aminoglicósidos en leche y tejidos bovinos y fue desarrollada en parte de los métodos presentados en las Referencias 1 y 2.
Materiales y Métodos
Condiciones UPLC
Sistema: ACQUITY UPLC
Columna: ACQUITY HSS PFP 2.1 x 100 mm, 1.7 μm (P/N 186005967)
Volumen de inyección: 30 μL
Temperatura: 35 °C
Fase móvil A: 20 mM HFBA en agua
Fase móvil B: 20 mM HFBA en acetonitrilo
Caudal: 50 mL/min
Gradiente: Lineal, 20% a 80% B en 7 min, 80% B hasta 8 min, retorno a 20% B a 8.1 min. Mantenimiento y reequilibrio por 10 min.
Condiciones MS
Espectrómetro de masa: ACQUITY TQD
Modo: Electrospray positivo (ES+)
Capilar: 3.0 kV
Extractor: 3.0 V
Temperatura de fuente: 130 °C
Gas de cono: 20 L/h
Temperatura de desolvatación: 450 °C
Gas de desolvatación: 900 L/h
Gas de colisión: argón 0.20 mL/min
Preparación de la muestra
Buffer de extracción (NH4Ac 10 mM - Na2EDTA 0.4 mM - NaCl 1% - TCA 2%):
Colocar 0.77 g de acetato de amonio en un matraz de 1L, agregar unos 900 mL de agua y disolver. Ajustar el pH a 4.0 con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio 1 N. Agregar 0.15 g de etilendiaminotetraacetato de sodio (Na2EDTA.2H2O), 5 g de cloruro de sodio y 20 g de ácido tricloroacético (TCA). Mezclar bien para disolver y completar con agua.
Extracción inicial
Llevar 2 g de tejido bovino homogeneizado o 10 mL de leche a un tubo de centrífuga de 50 mL. Agregar 20 mL de buffer de extracción y mezclar a modo vórtice por 10 segundos. Agitar bien por 1 minutos, centrifugar a 4000 RPM por 5 minutos y recolectar el sobrenadante. Ajustar el pH del sobrenadante a 6.5±0.5 usando HCl o NaOH diluido según sea necesario.
Cleanup SPE
En este estudio se utilizaron placas Oasis HLB DE 30 mg. En caso de preferir cartuchos individuales, pueden usarse cartuchos de 1 cm3- 30 mg. Los cartuchos o pozos de la placa se acondicionan con 1.5 mL de metanol, seguidos por 1.5 mL de agua. El caudal deberá estar en 1 mL/min o menos. Luego se carga el sobrenadante obtenido de la extracción inicial, ajustados en pH. Se utiliza una alícuota de 1 mL de muestra de tejidos o 1.5 mL de la muestra de leche. Se lava con 1 mL de agua y se eluye con 0.5 mL de una mezcla de ácido fórmico-isopropanol-agua (10:5:85). Se agrega 1.5 μL de HFBA y se analiza usando UPLC/MS/MS.
Resultados y discusión
La Figura 2 muestra un cromatograma UPLC/MS/MS obtenido por análisis de una muestra de leche bovina enriquecida. Las mismas condiciones se usan para muestras de músculo bovino. Los resultados obtenidos en muestras enriquecidas se muestran en la Tabla 2 (leche) y Tabla 3 (tejido muscular). La neomicina (B y C) y gentamicina (C2a y C2) existen como una mezcla de isómeros isobáricos y son parcialmente resueltos. Para la cuantificación se utiliza la suma del área de los pares de picos.
La recuperación se determinó comparando el área de picos MRM en muestras de matriz con y sin enriquecimiento con antibióticos, previamente a la preparación de la muestra.
El efecto matriz fue inferior al 30% para carnes y menor de 12% para leche.
Contrariamente a otros antibióticos usados en medicina veterinaria, los aminoglicósidos no pueden extraerse de los tejidos animales y muestras relacionadas usando solventes orgánicos. Sin embargo, estos compuestos pueden extraerse eficientemente usando buffers acuosos. Esta extracción incluye el uso de un agente (TCA) para facilitar la precipitación de proteínas.
El uso de un eluyente de bajo contenido orgánico en el protocolo de Oasis HLB SPE resultó en un cleanup mejorado como alternativa a la elución con metanol (el uso de ácido fórmico-metanol como eluyente, derivó en la absorción de mayor cantidad en el cartucho, luego de la elución de aminoglicósidos).
Como modo separativo se escogió la fase reversa con apareamiento iónico en UPLC. El mejor compromiso entre la geometría de pico y la sensibilidad se obtuvo usando 20 mM de ácido heptafluorbutírico como agente de apareamiento. También se evaluó el uso de UPLC con columnas HILIC, pero la morfología de los picos resultó mucho más favorable utilizando el método finalmente propuesto. Adicionalmente, una desventaja del modo "HILIC mode" es que si el diluyente estándar y muestras hubiera sido acetonitrilo y el protocolo optimizado SPE, utiliza una muestra acuosa más apropiada para el análisis en fase reversa.
Conclusiones
La columna analítica ACQUITY UPLC HSS PFP de UPLC mostró un excelente desempeño en modo fase reversa con apareamiento iónico.
El ácido heptafluorbutírico (HFBA) fue un agente de apareamiento efectivo en el análisis por RP-IPC en UPLC.
Se presenta como un procedimiento simple y rápido para la extracción de antibióticos aminoglicósidos en carne y leche bovina. Un operador puede analizar fácilmente unas 20 muestras por día.
Se presenta como un protocolo optimizado SPE, usando una placa Oasis HLB de 96 pocillos.
Puede demostrarse un LOQ = 10 ppb en leche bovina y 50 ppb en músculo bovino, con relación a la señal a ruido mayor que 100:1 para todos los analitos en esos niveles.
Referencias
1. Michael S. Young, Kim van Tran, Evelyn Goh, and Jeremy C. Shia Waters Corporation, Milford, MA, USA.
2. Screening and Confirmation for Aminoglycosides by UHPLC-MS-MS (United States Department of Gariculture Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science).
3. Plozza T, Trenerry VC, Zeglinski P, Nguyen H, Johnstone P. The Confirmation and Quantification of Selected Aminoglycoside Residues in Animal Tissue and Bovine Milkby Liquid Chromatography Tandem MassS pectrometry. International Food and Research Journal. 2011; 18 (3): 1077-1084.
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