Esterilización por Aire Caliente a 180 °C Método reconocido y validado para eliminar la contaminación microbiana en incubadoras de CO2

Introducción

La contaminación microbiana, causada por bacterias, esporas bacterianas, virus, mycetozoa, hongos levaduras y otros microorganismos, frecuentemente presenta un gran riesgo en experimentos de cultivo celular. Esta contaminación muchas veces no es detectada previamente sino al final del proceso de cultivo celular. Efectos más sutiles, como la disminución de la concentración de nutrientes esenciales y la segregación de metabolitos microbianos son causadas por leves cambios en el pH, el cual para células humanas y de mamíferos tiene que ser mantenido en el rango de 7.4-7.6; la hiper-acidez resultante del medio de cultivo disminuye la tasa de crecimiento. Los cambios en la morfología de la célula madre (host) y aún los cambios genéticos como la aberración cromosómica y traslocación, pueden, por ejemplo, ser causadas por una infección por micoplasma. En casos extremos, un solo germen puede destruir el trabajo de semanas y meses de esfuerzo de investigación.

Las causas de la introducción de gérmenes o dispersión de la contaminación pueden ser innumerables: uso de líneas de células, medio, suero u otros reactivos con contaminación escondida, bacterias en el aire o equipos de laboratorio que no hayan sido esterilizados o desinfectados apropiadamente, o la contaminación introducida accidentalmente por los técnicos de laboratorio.

Como la verificación de presencia de gérmenes frecuentemente envuelve procedimientos complicados y tediosos, se tienen que iniciar medidas para el control de la contaminación.

La importancia del control de la contaminación cuando se trabaja con líneas de células y cultivos primarios

En vista del progreso significativo en el área de aplicaciones de cultivos celulares sensibles, como la ingeniería de tejidos o terapia regenerativa de células y tejidos, los requerimientos de una incubadora de CO2 han cambiado.

Los estándares más estrictos son aplicados a la confiabilidad de la cadena entera de procesos, en la cual una incubadora de CO2 ocupa una posición clave, ya que debe replicar las condiciones naturales in vivo para un crecimiento celular óptimo lo más preciso posible. Para toda terapia de base celular, por ejemplo una suspensión celular de crondocitos autólogos para reimplantes en un paciente, el problema yace en que el producto final mismo no puede esterilizarse. Por esta razón, los lineamientos como Good Manufacturing Practice (GMP)1, la guía para una buena práctica de cultivo celular (GCCP)2 así como Las Directivas Europeas de Tejido Humano3, entre otras, recomiendan el uso de artículos descartables estériles y/o equipamiento que puede ser esterilizado para el procesamiento de células y tejidos humanos. Condiciones estériles deben ser garantizadas para cultivos celulares in-vitro a lo largo de todo el período de cultivo, ya que además del riesgo de esparcir la contaminación, está presente el riesgo de vida de infectar a pacientes.

Desinfección, esterilización, descontaminación

La esterilización es la completa eliminación y/o ausencia de microorganismos viables; desinfección es la eliminación e inactivación de todos los patógenos presentes, los cuales frecuentemente representan una cantidad parcial de todos los contaminantes presentes. El término "descontaminación" se puede usar en varias formas, como la remoción de contaminación biológica, química o radioactiva, pero que a menudo no permite una conclusión precisa y cuantificable con referencia a su efectividad.

En cuanto a los mecanismos y verificación de la efectividad de los métodos de desinfección y esterilización, existen una gran cantidad de guías y estándares, particularmente para el uso en la industria farmacéutica y el sector clínico.

Las pharmacopeas básicamente especifican la esterilización por autoclave, la esterilización por aire caliente y el uso de óxido de etileno y métodos de filtración estéril y esterilización. La aplicación apropiada de un método específico a una aplicación específica debe ser, por consiguiente, escrutinada cuidadosamente y el proceso de esterilización usado requiere una validación con organismos de ensayos definidos.

Para una esterilización efectiva, las pharmacopeias4 diversas concuerdan en una reducción logarítmica decimal de 6 órdenes, de microorganismos viables, lo que equivale a un microorganismo viable en un millón, 1:1000000 unidades. Esto corresponde a una reducción de 99.9999% en el número de microorganismos de ensayo que fueron inicialmente usados.

El desarrollo de los conceptos de des-contaminación para Incubadora de CO2

Los diversos fabricantes de incubadoras de CO2 han desarrollado conceptos muy diferentes para la prevención y control de la contaminación; recientemente se ha incrementado el foco de atención en la seguridad del proceso, efectividad y costo. En este contexto, el requerimiento para esterilidad de un cultivo celular dentro de una incubadora de CO2 ha creado desafíos tecnológicos significativos.

Para elegir un método de descontaminación adecuado, se tienen que tener en cuenta los siguientes aspectos:

• Que la cámara interna de la incubadora esté preparada para una desinfección periódica por spray o por limpieza con alguna tela adecuada, que es el proceso standard para reducir la carga biológica (la carga microbiológica del sistema de incubadora de CO2). Metal de fácil limpieza y superficies de vidrio (interior de la incubadora, y la puerta de vidrio que cierra el espacio de trabajo) que no tengan soldaduras y, de ser posible, sin conexiones de rosca y/o elementos que deben ser desmantelados o quitados previo a una desinfección (ventiladores internos, tapas de ductos de aire), para permitir una limpieza rápida y mojado uniforme de todas las superficies internas con desinfectantes. Reduciendo el número de accesorios internos, como sistemas de racks deslizantes, o sistemas de humidificación al mínimo para minimizar la contaminación potencial de superficies interiores.

• Prevención de la condensación que puede servir como una caldo de alimentación para gérmenes en el interior de la incubadora.

• Eliminación segura de contaminación potencial a través de un proceso efectivo y verificable de esterilización.

Además, el sistema de cultivo celular usado debe prevenir la introducción de gérmenes aéreos, algunos de los cuales están presentes aún en condiciones de salas limpias. Las botellas de cultivo celular con filtros bacterianos de 0.2 μm son adecuadas para este propósito.

Los siguientes procesos de descontaminación se encuentran en el mercado:

• Desinfección por aire caliente a temperaturas entre 120 °C y 140 °C, usadas en diferentes tiempos de contacto y de ciclos (a veces combinados con sistemas de filtros HEPA), que no representan una esterilización por aire caliente, de acuerdo a las pharmacopeas, (ver Figura. 1)
Para un proceso usando calor seco a
140 °C, una reducción logarítmica de 6 órdenes fue indicada para B. Subtilis var. Niger spores ATCC #93725.

• Desinfección con vapor húmedo a 90° lo que ha mostrado que esporas térmicamente más resistentes pueden no ser eliminadas.

• Una combinación de procedimientos: vapor húmedo 95°C/descontaminación por aire caliente145 °C, en conjunto con filtros HEPA, para los cuales no hay estudios en cuanto a su efectividad, y en los cuales se tienen que reemplazar regularmente los filtros HEPA luego de cada procedimiento de descontaminación.

• Sistemas de filtros HEPA con diferentes tamaños de poro, por ejemplo 0.3 μm, los cuales alcanzan la reducción de partículas dentro de la atmósfera de la incubadora, pero que necesitan un service constante.

• Cámaras interiores hechas de cobre para liberar iones de cobre bactericidas, (que actúan como citotoxinas en la cadena respiratoria de los metabolismos bacterianos). Este efecto ha sido conocido por cientos de años y ha sido científicamente sostenido. Sin embargo, no es adecuado para todos los tipos de especies de bacterias o esporas bacterianas o fúngicas y tampoco es adecuado para virus, ofreciendo protección limitada. Además, los iones de cobre liberados son tóxicos para los humanos. Este proceso decolora las superficies de cobre en la incubadora. La efectividad de la aleación de cobre con acero inoxidable o de acero inoxidable enriquecido con cobre en organismos de ensayos, según lo demostrado en una serie de experimentos, usualmente alcanza a 99.847% hasta un máximo de 99,998%, lo cual no cumple con los requerimientos de esterilidad.

• Tratamiento UV aplicando radiación UVC no ozonogénica con una longitud de onda de 253.7 nm. El efecto mutante de la radiación UV ha sido comprobado. Su efectividad, sin embargo, depende directamente de la irradiación directa, ya que tiene una penetración limitada. Por consiguiente, es adecuado para el tratamiento de superficies. El uso de radiación UV para desinfección de agua es muy conocido. La efectividad del tratamiento de agua en sistemas de humidificación en incubadoras ya ha sido descripto8; sin embargo, parece que un tratamiento UV adicional no es necesario, si el agua en la bandeja de humedad es reemplazada regularmente con agua estéril destilada (los fabricantes recomiendan hacerlo de una a dos veces por semana). Además, para gérmenes aéreos, el efecto germicida de esta opción parece inútil ya que el tiempo en el área de irradiación directa es marginal.
Wallhäußer et. al.4 notan un efecto decreciente de la radiación UV a humedad ambiente mayor a 80% HR.

• Esterilización por aire caliente a temperaturas ≥160°C, por calor seco, a tiempos de exposición definidos en las pharmacopeas (ver Figura 1). Evidencia de una esterilización exitosa de gérmenes de ensayo conforme a USP ha sido comprobada por programas individuales de esterilización por aire caliente.

Estándares Internacionales concernientes a la esterilización por aire caliente

Un requerimiento básico es que el periodo de contacto para los elementos a ser tratados (las superficies interiores en el caso de las incubadoras de CO2), sea apropiado. El tiempo del ciclo puede ser calculado permitiendo los tiempos adicionales para calentar y enfriar el sistema.

Como regla básica, a mayor temperatura de esterilización, menor el tiempo de esterilización requerido.

En publicaciones recientes, el foco ha sido en el tiempo total del procedimiento de decontaminación y la necesidad para una decontaminación continua; cualquier revisión crítica debería también considerar el tiempo de proceso real requerido, así como los costos de manutención y de incorporación de componentes, como el reemplazo de los filtros HEPA y de las lámparas UV, así como los costos asociados con la desinfección subsiguiente recomendada, vía spray o con una tela adecuada. En este punto, se debe dar una atención especial al hecho que los procesos anteriormente mencionados, excepto el de esterilización por aire caliente a temperaturas ≥160 °C con el tiempo de exposición necesaria, NO constituyen procesos que cumplen con los estándares en términos de las pharmacopeas mencionadas y, por consiguiente, no son métodos considerados como métodos de esterilización aprobados.

Comparación de diferentes conceptos de descontaminación en cuanto a la seguridad de los procesos, efectividad y manejo de costos

• Desinfección usando vapor húmedo a 90 °C como calor húmedo: La ventaja es que un gran volumen del vapor puede generarse con una cantidad relativamente pequeña de agua. Sin embargo, este proceso no es comparable con la esterilización por autoclave con vapor a 121ºC. Se ha comprobado que la efectividad en esporas resistentes a la temperatura de la especie Bacillus subtilis and Bacillus stearothermophilus es no satisfactoria6,9. En ciertos casos, el tiempo requerido de un ciclo es de al menos 25 horas, seguido por una consecuente recalibración del sistema de sensor de CO2. La condensación producida por el enfriamiento del vapor húmedo crea un riesgo potencial de recontaminación del acero inoxidable en las superficies internas. El fabricante recomienda una desinfección posterior usando spray o un desinfectante apropiado, incluyendo el uso de paños estériles.

• El uso de filtros HEPA para reducir la concentración de partículas en salas limpias o bancos limpios es un proceso efectivo reconocido y verificable. Sin embargo, la aplicación de filtros HEPA para controlar la contaminación en incubadoras de CO2 depende de las siguientes condiciones:
- El aire de la incubadora es aspirado hacia el filtro HEPA con una eficiencia de remoción definida a través de una succión generada por un ventilador, con filtros adecuados, se alcanza reducción en la carga de partículas de la incubadora.

• En algunas incubadoras de CO2, esta circulación de aire forzado también es querida para una distribución homogénea de la temperatura y/o una homogeneización de la concentración de CO2 en la incubadora.
• Sin embargo, los filtros HEPA contienen gérmenes viables, lo cual implica un reemplazo regular de los filtros. Se recomienda autoclavar los filtros antes de descartarlos.

• Los ciclos de desinfección por vapor húmedo o seco en incubadoras de CO2 con filtros HEPA requieren un reemplazo rutinario de filtros (los filtros deben ser reemplazados previo a empezar el proceso de descontaminación). Si este procedimiento se lleva a cabo en forma regular esto puede significar costos considerables.

• Una reducción de partículas dentro de una incubadora puede minimizar el riesgo de contaminación en sistemas de cultivos abiertos, como cuando se trabaja con placas de Petri.

• Cuando se usan contenedores de cultivo celular de alta calidad con filtros integrados para bacterias en la tapa a rosca, una reducción de partículas en la atmósfera de la incubadora de CO2 no sería necesaria.

• La aplicación de la radiación UV en combinación con una aleación de cobre y acero inoxidable fue descripta con anterioridad8. Para un tratado intensivo de todas las superficies interiores, el fabricante recomienda una irradiación directa de UV por 24 horas. Esto requiere previamente el desmantelar el sistema de deslizamiento de los racks junto con los componentes del plenum, incluyendo el ventilador. Al mismo tiempo, todas las conexiones interiores deben ser autoclavadas. Luego del ciclo UV, todas las superficies interiores deben ser, una vez más, desinfectadas con alcohol isopropílico al 70% y un paño estéril. Para una aplicación rutinaria, este proceso parece relativamente costoso en dinero y en horas hombre, comparándolo con una esterilización por aire caliente usando un ciclo nocturno. A pesar de la relativamente larga vida útil de los sistemas de lámparas UV (1000 horas de acuerdo a las especificaciones del fabricante), el reemplazo de las lámparas puede volverse costoso.

El concepto BINDER de minimizar la superficie de contaminación y eliminar efectivamente la misma.
Las incubadoras de CO2 de BINDER series CB y C150 están diseñadas para una desinfección fácil vía spray o con desinfectante y paño y para una auto-esterilización rutinaria.

Este diseño personalizado facilita su aplicación y no requiere reemplazos costosos de partes como filtros HEPA y lámparas UV. Contiene lo siguiente:

• Cámara interna de una sola pieza, sin soldaduras, de fácil limpieza con 27% menos superficie para una contaminación potencial, y un sistema integrado de montaje de estantes para minimizar también la contaminación de la superficie.

• Ausencia de condensación, aún cuando se trabaja bajo condiciones de aire húmedo altamente saturado y superficies de acero inoxidable mecánicamente pulidas sin soldaduras, para prevenir el anidamiento de gérmenes aéreos.

• Esterilización por aire caliente a 180ºC, verificable, efectiva y automática, acorde a estándares que puede ser realizada convenientemente durante la noche. Cumple con las normas internacionales de esterilización por aire caliente.

Referencias de lineamientos Internacionales

• US Pharmacopoeia www.usp.org

• Pharmcopeia Europea 1997 5.1.1.

• American Dental Association www.ada.org.

• Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI) www.aami.org.

• German Institute for Standardization (DIN) www2.din.de.

• Pharmacopoeia Nordica Online Reference via www.dekker.com.

• Federal Law Gazette 22, No. 10, performing sterilization, Appendix to sub-paragraph 7.1 of the Guideline for the identification, prevention and control of infection in hospitals, Ordinance for the prevention of infetious disease (Hygiene Directive)], Robert-Koch-Institut, 2003.

• Japanese Pharmacopoeia www.jpdb.nihs.go.jp/jp14e.

• British Pharmacopoeia Commission Methods of Sterilization. London, UK: Appendix X VIII, 2003.

1. http://www.fda.gov/cdrh/comp/gmp.html

2. S. Coecke et. al. Guidance on Good Cell Culture Practice, A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture (GCCP), ATLA 33, 261-287, 2005.

3. European Human Tissue Directive, 2006/17/EC implementing Directive 2004/23/EC of the European Parliament and of the Council as regards certain technical requirements for the donation, procurement and testing of human tissue and cells.

4. K.H. Wallhäußer, Practice of Sterilization, disinfection – Conservation, Germ Identification, 5. edition, 1995.

5. J.Dalamasso, APEX Laboratories, Effective Heat Sterilization in CO2-incubators , Vol. 4, No. 3, Thermo Electron Corporation's Heat Sterilization White Paper, 2003.

6. P. Distler, 180 °C Hot air sterilization: a safe method against microbiological contamination in CO2-incubators Lab Asia, November 2003, p. 11.

7. A. Campbell, D. Figel, Importance of Class 100 Air in a CO2-incubator, Vol. 4, No. 1, Thermo Electron Corporation's Class 100 Air White Paper, 2003.

8. H. Basujima, D. Mistry, Technical Development Report, Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd. A Comparative Analysis of Ultra-violet Light Decontamination versus High-Heat Sterilization in the Cell Culture CO2-incubator, with the Use of Copper-Enriched Steel Construction to Achieve Background Contamination Control™, 2007.

9. Biosafety Investigation Unit, CAMR, Efficacy of a CO2-incubator heat disinfection cycle on dried microbes, 1998.

Daniela Maurer, Dipl. Biochem., Scientific Product Management
BINDER GmbH, Tuttlingen

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