Validación de Métodos Microbiológicos Organismo Argentino de Acreditación

Un Laboratorio que realiza ensayos microbiológicos puede utilizar métodos cualitativos y/o cuantitativos, los cuales se basan en la capacidad natural de los microorganismos de desarrollarse en un determinado medio de cultivo, a fin de detectarlos y/o poder cuantificarlos.

El laboratorio debe utilizar métodos de ensayo, que satisfagan las necesidades del cliente y que sean apropiados para los ensayos que realiza, es decir ajustados a su propósito. Para ello puede utilizar:

• Métodos normalizados: Son aquellos métodos publicados como normas internacionales o nacionales, o por organizaciones técnicas reconocidas (Ej.: ISO, NMKL, UNE, EN, AOAC, APHA, FDA, EPA, Standard Methods for Water and Wastewater, USP, EP, etc.)
• Métodos alternativos: Se trata de métodos que han sido validados por comparación con el método de referencia que corresponda, de acuerdo a un estándar aceptado (ej. ISO 16140, ISO/TR 13843, ISO 17994) y son reconocidos formalmente como equivalentes al método de referencia por un organismo competente de acuerdo a unos datos experimentales obtenidos por ej. mediante ensayos colaborativos.
• Métodos no normalizados: Pueden considerarse aquellos métodos normalizados modificados o utilizados fuera de su alcance. Por ejemplo: otra matriz, otros medios de cultivo, diferentes tiempos/temperaturas de incubación, equipos con distintas tolerancias a las especificadas, combinación de partes del método normalizado con partes de una referencia bibliográfica, etc.
• Métodos internos: Son aquellos elaborados por el propio laboratorio y que no se encuentran en normas u otras colecciones de métodos.

El objetivo de este artículo es servir como guía para la validación de métodos de ensayo no normalizados, desarrollados o diseñados por un laboratorio, métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos. Esta guía será útil a los laboratorios que realizan ensayos microbiológicos utilizados en el análisis de agua y de alimentos destinados al consumo humano y a la alimentación animal, a muestras ambientales en el ámbito de la producción y manipulación de alimentos y, en productos farmacéuticos o cosméticos.

Requisitos generales para las actividades de validación y para la estimación de la incertidumbre de medición
La validación de los métodos de ensayo y la estimación de la incertidumbre de medición debe ser realizada por miembros del personal, experimentados y competentes. Es importante que el laboratorio opere bajo un sistema de aseguramiento de la calidad de sus ensayos y que los equipos e instrumentos sean calibrados y/ o validados antes de su uso.

Para la validación/verificación de los métodos, el número y categoría de matrices a analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditación y debe basarse en referencias bibliográficas o estándares reconocidos.

Del mismo modo, para la estimación de la incertidumbre debe tenerse en cuenta el tipo de matriz, el microorganismo y el método empleado. El número y categoría de matrices que se analicen también debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditación y basarse en referencias bibliográficas o estándares reconocidos.

Las actividades de validación y las de estimación de incertidumbre de medición deben reflejar las condiciones reales de la aplicación de los métodos de ensayo, es decir, deben tener en cuenta las condiciones encontradas en la práctica diaria.

Por ello pueden utilizarse muestras naturalmente contaminadas, contaminadas por mezcla, o en su defecto muestras inoculadas o materiales de referencia. Cuando se utilice la inoculación, será necesario considerar la presencia de la flora acompañante a fin de evaluar posibles interferencias, según la naturaleza del método y de la matriz. Para ello se pueden utilizar matrices estériles inoculadas, con el microorganismo diana y con cepas distintas a la diana en concentraciones superiores.

También pueden utilizarse muestras no esterilizadas inoculadas, que hayan demostrado previamente la ausencia del microorganismo diana. El nivel del inóculo debe ser acorde a lo analizado por el laboratorio en la práctica diaria y lo especificado por el método de ensayo, por ejemplo el análisis de muestras de alimentos con alta carga y baja carga en la determinación de Salmonella. También debe tenerse en cuenta el estado fisiológico del/los microorganismo(s) de acuerdo a las matrices analizadas.

Tanto en la validación como en el cálculo de la incertidumbre de medición se debe tener en cuenta el rango de trabajo que emplee el laboratorio en sus análisis de rutina.

Se debe designar a un Responsable que tenga las calificaciones y la competencia necesarias, para evaluar el diseño experimental y los resultados obtenidos, tanto en la validación de los métodos como en la estimación de la incertidumbre de medición. Éste decidirá además las acciones a seguir en caso que no se obtengan los resultados esperados.

Adicionalmente, es importante señalar que no se puede utilizar la participación en Ensayos de Aptitud (EA) como único método para la validación, ni para la estimación de la incertidumbre de medición. Esto se debe a que en las rondas de EA, las matrices, en muchos casos, son diferentes a las que analiza el Laboratorio en su rutina diaria y no tienen en cuenta la presencia de flora acompañante; además las muestras distribuidas durante la ronda, han sido especialmente homogeneizadas y estabilizadas y los niveles de microorganismos en las muestras del EA, pueden no ser aquellos que el laboratorio analiza rutinariamente y pueden no cubrir el rango encontrado en el trabajo diario; por último, los laboratorios participantes, utilizan una variedad de métodos empíricos para obtener su resultado, por lo cual para evaluar el resultado de la ronda se utilizan valores de consenso. Sin embargo la participación en EA, puede utilizarse como actividades complementarias a la validación y pueden dar una indicación de la precisión obtenida para un método en particular.

VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS
El término "validación" se utiliza para indicar el proceso que provee evidencia objetiva que el método es capaz de servir a su uso esperado, es decir para detectar o cuantificar un microorganismo o grupo de microorganismos específicos, para lo cual deben determinarse sus características de desempeño a fin de comprobar que cumple con los requisitos especificados para ese uso particular. Mientras que el término "verificación" se utiliza para indicar el proceso que lleva a cabo el laboratorio con el fin de demostrar su capacidad para ejecutar correctamente un método normalizado cuando lo realiza exactamente como está descripto en la norma.

Proceso de validación

1. Conocer el problema analítico a resolver. Los procedimientos y el alcance de la validación no son siempre los mismos. Deben ser establecidos de acuerdo a las características del método de ensayo utilizado por el Laboratorio y tener en cuenta las necesidades del cliente.
2. Planificar las acciones a seguir. Esto implica especificar los requisitos y condiciones a cumplir, determinar los parámetros de desempeño del método, establecer el diseño experimental y el método de análisis de resultados. El diseño experimental y el análisis de resultado tienen que ser estadísticamente válidos. En esta etapa es fundamental definir el alcance de la validación de acuerdo al método a emplear, especificar la matriz o matrices a estudiar; establecer condiciones tales como temperatura y tiempo de incubación, límites de operación; realizar una clara descripción del/los microorganismos de interés; y establecer otras limitaciones y especificaciones. Si los parámetros de desempeño no están ya especificados, el laboratorio debe decidir cuáles deben ser caracterizados con el fin de validar el método, lo cual deberá estar fundamentado de manera confiable y científica. En todos los casos se requiere un Protocolo de validación cuya elaboración se explicará más adelante.
3. Llevar a cabo la validación y evaluar los resultados obtenidos, por comparación con los parámetros de desempeño establecidos. Confirmar la validez del procedimiento utilizado de acuerdo al propósito establecido y, si se han satisfecho los requisitos.

Protocolo de validación
Con el fin de organizar y planificar las actividades de la validación se debe elaborar un protocolo de validación que incluya:

Objetivo
Alcance: ámbito de aplicación del ensayo a validar. Aquí tiene suma importancia la especificación de la matriz, especialmente cuando pueden causar diferencias significativas en la recuperación de los microorganismos y el rango de aplicación en el caso de los ensayos cuantitativos.
Personal que llevará a cabo la validación
Metodología y diseño experimental. Este debe incluir: la definición del analito, la naturaleza de las muestras (naturales o inoculadas) utilizadas para la validación, el acondicionamiento y preparación de las mismas, los microorganismos utilizados, la estandarización del inóculo, las condiciones del ensayo, etc.
Listado de equipos, instrumentos, materiales, medios de cultivo, reactivos y cepas de referencia.
Condiciones ambientales, cuando corresponda.
Parámetros de desempeño a determinar.
Criterios de aceptación para cada uno de los parámetros.
Análisis estadístico
Metodología para el cálculo de la incertidumbre, cuando corresponda.
Registros asociados
El Protocolo de validación debe ser revisado y aprobado por el Responsable.

Informe de validación
Debe reflejar el protocolo de validación e incluir
Resultados obtenidos, incluyendo la incertidumbre de medición, cuando corresponda a un método de ensayo cuantitativo.
Conclusiones y declaración de conformidad sobre la aptitud del método de ensayo, fundamentada en la evaluación de los parámetros de desempeño respecto a los criterios establecidos.

Criterios de revalidación
El Responsable debe justificar y fundamentar apropiadamente si considera al método adecuado, aún cuando se hayan producido desviaciones del protocolo o, cuando uno de los puntos del informe no concuerde con el requisito establecido previamente, por ejemplo los criterios de aceptación. Se deben adjuntar al informe de validación los datos originales o hacer referencia en donde estos se encuentren. El Informe de validación debe ser revisado y aprobado por el Responsable.

ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDICIÓN
Para todos los métodos, ya sean cualitativos o cuantitativos, el laboratorio debe identificar las distintas fuentes de incertidumbre, como por ejemplo, la homogeneidad de los reactivos, la interpretación de los analistas, etc. y demostrar que se encuentran bajo control. Esto puede realizarse de muchas maneras, tales como diagramas de flujo, tablas, listas o diagramas de causa-efecto (espina de pescado).

Métodos de ensayo microbiológicos cualitativos: El concepto de cálculo de incertidumbre de medición no puede aplicarse directamente a los resultados de los ensayos cualitativos como los obtenidos en los análisis de detección o en los de determinación de atributos para fines de identificación. No obstante, el laboratorio debe determinar el límite de detección, basado en requisitos de especificidad y sensibilidad y realizado en matrices representativas, teniendo en cuenta, cuando corresponda la presencia de la flora acompañante, ya que es un importante indicador de la validez del método en el laboratorio y determinar la incidencia de resultados falsos positivos y falsos negativos asociada a los ensayos cualitativos que se realizan (Tasa de Falsos Positivos y Tasa de Falsos Negativos). Esta no debe exceder las recomendaciones publicadas, ya sea en la literatura (normas o publicaciones relevantes al sector) o por los fabricantes, en este último caso para los métodos alternativos o de confirmación rápida.

Métodos de ensayo microbiológicos cuantitativos: El laboratorio debe realizar un cálculo para estimar la incertidumbre asociada a sus ensayos cuantitativos. Existen diferentes modelos para estimar la incertidumbre para ensayos cuantitativos, el laboratorio puede utilizar aquel que, basado en un pensamiento crítico y en el mejor juicio profesional, estime conveniente. La estimación de la incertidumbre de medición debe realizarse para resultados válidos, es decir aquellos que se encuentran dentro de los límites de recuento especificados en el método.

Ensayos que utilizan el Número Más Probable (NMP) para determinar el número de microorganismos en una muestra de ensayo: Para estos ensayos el laboratorio puede utilizar los límites de confianza de las tablas, siempre que identifique las combinaciones inusuales e investigue sus causas y demuestre que la precisión (determinada por ejemplo, mediante el análisis de duplicados) se encuentra dentro de dichos límites.

El presente artículo fue elaborado con objetivos de difusión a partir del documento del Organismo Argentino de Acreditación DC-LE-08 v1. En caso de querer solicitar la acreditación de su laboratorio, se recomienda descargar la versión vigente de los documentos requeridos en el sitio web del OAA www.oaa.org.ar. Para mayor información comunicarse con el Organismo Argentino de Acreditación por teléfono al (54-11) 4349 3962 / 71 o por mail al info@oaa.org.ar