Análisis de un Anticuerpo Monoclonal por cromatografía de exclusión por tamaño (UPLC - SEC)
Introducción
Los anticuerpos monoclonales (mAb) se han convertido en una de las clases de proteínas predominantes en el campo bioterapéutico. Tanto el nivel como la valencia de agregación de las proteínas solubles son atributos de calidad críticos (CQA) que deben controlarse para las preparaciones de mAb destinados al uso humano. La agregación de proteínas - que puede ocurrir durante todo el proceso de fabricación a partir del cultivo celular o a través de la vida útil del producto farmacéutico - puede ser indicativo de la desnaturalización parcial u otras perturbaciones de la estructura de las proteínas que podrían afectar perjudicialmente a la seguridad y eficacia de la proteína bioterapéutica(1). Si bien es importante evaluar cuantitativamente los niveles de agregados de baja valencia (por ejemplo, dímeros) como una medida del proceso, estabilidad y seguridad del producto, también es crítica para dilucidar la distribución de agregados multiméricos de alta valencia solubles en preparaciones bioterapéuticas de proteínas. Estos agregados multiméricos pueden ser más eficaces en la provocación de una respuesta inmune, debido a su capacidad para activar una vía independiente de la participación inmunológica de células T(2).
La reciente incorporación de columnas de exclusión con un tamaño de poro de 450 Å, en partículas con un diámetro inferior a 3 µm, ha permitido ampliar el campo de separación de pesos moleculares por exclusión por tamaño (UPLC-SEC) para incluir macromoléculas biológicas con grandes radios de hidratación (Rh), tales como IgM y proteínas asociadas multiméricas(3).
En este estudio se evaluó un material de relleno constituido por partículas de 2,5 µm de diámetro y 450 Å de poro (BEH450) para el análisis de un mAb. Los datos demuestran las ventajas de la separación de exclusión por tamaño basada en la cromatografía liquida de Ultra Performance (UPLC) en comparación con la cromatografía liquida (HPLC) para la separación de complejos de proteínas macromoleculares y los beneficios de las columnas UPLC BEH SEC combinadas de 200 Å y 450 Å de poro para el análisis de una muestra de mAb que contiene agregados multiméricos de alta valencia.
La reciente incorporación de columnas de exclusión con un tamaño de poro de 450 Å, en partículas con un diámetro inferior a 3 µm, ha permitido ampliar el campo de separación de pesos moleculares por exclusión por tamaño (UPLC-SEC) para incluir macromoléculas biológicas con grandes radios de hidratación (Rh), tales como IgM y proteínas asociadas multiméricas(3).
En este estudio se evaluó un material de relleno constituido por partículas de 2,5 µm de diámetro y 450 Å de poro (BEH450) para el análisis de un mAb. Los datos demuestran las ventajas de la separación de exclusión por tamaño basada en la cromatografía liquida de Ultra Performance (UPLC) en comparación con la cromatografía liquida (HPLC) para la separación de complejos de proteínas macromoleculares y los beneficios de las columnas UPLC BEH SEC combinadas de 200 Å y 450 Å de poro para el análisis de una muestra de mAb que contiene agregados multiméricos de alta valencia.
EXPERIMENTAL
Descripción de las muestra
Todas las muestras se diluyeron en fase móvil a menos que se haya indicado lo contrario. Las proteínas fueron compradas como estándares individuales o como mezclas. La muestra mAb IgG1 es el biofármaco trastuzumab que se analizó pasada su fecha de vencimiento. Las concentraciones de la muestra fueron de 1,0 mg/ml (nominal).
Condiciones experimentales (a menos que se indique lo contrario)
Condiciones cromatográficas
Sistema:ACQUITY UPLC H-Class Bio con horno calefactor para columnas de 30 cm.
Detección: Detector ACQUITY UPLC TUV con celda de titanio de 5 mm de paso óptico
Detector Light scattering Wyatt miniDAWN TREOS
Longitud de onda: 280 o 214 nm
Columnas: ACQUITY UPLC PrST SEC, 450Å, 2.5 μm, 4.6 x 150 mm (p/n 176002996) y 4.6x 300 mm (p/n 176002997)
ACQUITY UPLC PrST SEC, 200Å, 1.7 μm, 4.6 x 150 mm (p/n 186005225) y 4.6x 300 mm (p/n 186005226)
Columna HPLC: Silica-based, diol bonded 450Å, 8 μm, 7.8 x 300 mm
Temperatura de la columna: Ambiente
Temperatura de la muestra:10 °C
Volumen de inyección: 5 μL
Caudal:0.35 mL/min
Fase móvil: Fosfato de sodio 5 mM, Cloruro de sodio 250 mM, pH 6.8 (preparado usando la tecnología Auto•Blend Plus)
Gradiente: Isocrático
Standard:BEH450 SEC Protein Standard Mix (p/n 186006842)
Software:Waters Empower® 3 Software
Waters UNIFI® Information System
Wyatt Astra Software
Detalles experimentales de Cross-linking
Los agregados covalentes de IgG de alto peso molecular se prepararon usando el estándar Waters® Intact mAb (p/n 186006552) y un reactivo de cross-linking específico de lisina BS3 (Pierce, Rockford, IL). Las reacciones se realizaron con el anticuerpo a una concentración final de 10 mg/ml y una relación molar reactivo a proteína de aproximadamente 5:1 durante 30 minutos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Comparación de UPLC-SEC y HPLC-SEC de IgM y IgM dímero
Los resultados obtenidos con la columna de UPLC BEH450 son comparados con los obtenidos con una columna de HPLC con partículas de 8 µm base sílica en la separación de IgM, una inmunoglobulina pentámera con un peso molecular de 900 KDa y la forma di-pentámera de peso molecular 1.8 MDa (Figura 1). La cantidad de muestra inyectada y el caudal de trabajo son ajustados en base a la diferente geometría de las columnas usadas y ambos análisis son realizados en el mismo sistema cromatográfico Acquity UPLC H-Class Bio.
La columna BEH450 produjo una mejor separación significativa entre la forma di-pentámero y pentámera y una mejora de la sensibilidad con una altura de pico mayor en un 50% en comparación con la columna de HPLC. Esta notable mejora en la eficiencia de separación se debe principalmente a la disminución de tamaño de partícula. Además, se puede observar que el rango de resolución de pesos moleculares de la columna BEH450 se extiende por encima del dipentámero basado en la observación de las formas multiméricas del dímero de elución más temprana en el cromatograma.
Expansión del rango de pesos moleculares en el análisis de las agregaciones de mAb
La eficiencia excepcional proporcionada por la columna de la BEH450 para la separación de proteínas por encima del rango de peso molecular de la columna BEH200 (aproximadamente 450 kDa) sugiere que el uso de las dos columnas en serie puede proporcionar algunas ventajas para las separaciones UPLC-SEC a lo largo de un amplio intervalo de pesos moleculares. La comparación de la separación lograda con las columnas BEH200 y BEH450 solas (300 mm de longitud) y la versión de longitud de 150 mm de las dos columnas conectadas en serie (BEH200 seguida por BEH450) para la mezcla de proteínas estándar Waters® BEH200 SEC (p/N 186006518) se muestra en la Figura 2. Como la contrapresión generada por la columna de tamaño de partícula 1,7 µm BEH200 es mayor que la de la columna de tamaño de partícula 2,5 µm BEH450, la columna BEH200 se colocó primero en la serie para este estudio. El resultado de esta configuración de dos columnas se muestra en el panel central de la Figura 2.
Mediante el uso de dos columnas en serie se aumenta el rango de pesos moleculares superiores funcionales de la separación como se observa en la separación de la tiroglobulina y su dímero en comparación con la separación lograda usando una columna de 200Å sola. Además, para las formas de peso molecular inferior hay una mejora en la resolución en comparación con el uso de la columna de la 450Å solo tal como lo demuestra la separación mejorada entre IgG y BSA.
El uso de dos columnas SEC de diferente tamaño de poro puede proporcionar separaciones a través de un rango más amplio de pesos moleculares. Un ejemplo de tal separación es el agregado multivalente, trímero, dímero y las formas monoméricas de un anticuerpo monoclonal. Para demostrar esto fue procesada una muestra de IgG (P/N 186006552) para generar formas diméricas y multiméricas covalentes con el fin de obtener una muestra estable con un nivel abundante de especies multiméricas de un anticuerpo. Esta muestra se utilizó para definir el intervalo de peso molecular de las especies de mAb agregadas que pueden ser separadas por las columnas BEH200 y BEH450. La química de entrecruzamiento produce altos niveles de especies multiméricas que se caracterizan con facilidad por la medición de múltiples ángulos de dispersión de luz láser (MALS). Sin embargo, la polidispersidad de los picos incrementada debido a la naturaleza de la reacción de reticulación, también resulta de enlaces no cruzados del reactivo a las proteínas.
Los cromatogramas que se muestran en la Figura 3 junto con las asignaciones de picos basados en los datos de MALS demuestran las ventajas de usar las columnas BEH200 y BEH450 en serie. Para la separación utilizando sólo la columna BEH200 se obtiene una excelente resolución entre el monómero y dímero pero cuando se compara con la separación observada en la columna BEH450, la distribución de las formas agregadas de mayor peso molecular eluyen cerca del trímero y del volumen de exclusión total de la columna. Mediante el uso de las dos columnas en serie (cromatograma central en la Figura 3), la distribución de formas agregadas más altas se puede observar, mientras que se consigue una mejor resolución entre el monómero y el dímero en comparación con el uso de la columna de la BEH450 sola.
A continuación se investigó el uso de las columnas BEH200 y BEH450 en serie para el análisis UPLC-SEC de un anticuerpo IgG1 bioterapéutico (trastuzumab). Con el fin de generar una muestra más relevante para este estudio, la muestra de trastuzumab se sometió a una serie de eventos de congelación - descongelación para aumentar los niveles de agregados no covalentes en la muestra. Los niveles de los agregados fueron evaluados utilizando la columna BEH200 (longitud 300 mm) y las columnas BEH200 y BEH450 en serie (longitud de 150 mm c/u). Estos resultados (Figura 4) muestran que el uso de las dos columnas en serie proporciona una distribución de las formas agregadas multiméricas donde se puede observar una mejor separación entre las especies agregadas diméricas y triméricas en comparación con la columna BEH200 sola. Por el contrario, el uso de la columna BEH200 sola proporciona una mejor separación de los fragmentos de mAb que resultan de la escisión en la región bisagra de la mAb(4).
Mediante la evaluación de la variación del perfil cromatográfico durante el transcurso del estudio de congelación-descongelación se puede observar visualmente para ambas configuraciones de columnas que el nivel general de trímero soluble y agregado multimérico está aumentando. Ambas configuraciones de columnas también proporcionan resultados comparables para la determinación de los niveles relativos de dímero, así como para la sumatoria del trímero y el agregado multímero (Figura 5). Esta comparación cuantitativa requiere considerar el trímero y las formas multiméricas en forma conjunta debido que cuando se usa la columna BEH200 sola no es posible una integración exacta. El uso de las columnas BEH200 y BEH450 en serie proporciona un beneficio significativo para esta aplicación en el que las formas de trímeros y tetrámeros están más resueltos en comparación con el uso de la columna BEH200 sola. Además, la distribución de formas agregadas mayores en valencia que trímero y tetrámero se puede controlar mejor.
Estos resultados son consistentes con los presentados previamente (Figura 2) que demuestran que el intervalo de peso molecular superior de la columna BEH200 para una proteína globular es aproximadamente la de la tiroglobulina (667 kDa), casi el peso molecular de la IgG tetrámero (600 KDa). Por comparación, el intervalo de peso molecular superior de la columna BEH450 es aproximadamente la de IgM di-pentámero (1,8 MDa) que es el peso molecular de una IgG 12-mer. Esta información adicional proporcionada por la columna BEH450 de tamaño de poro más grande puede ser beneficioso en la caracterización de una proteína bioterapéutica ya que además de el nivel de agregación de la proteína, la valencia de esa agregación puede alterar potencialmente la inmunogenicidad.
CONCLUSIONES
Tanto los niveles y la naturaleza de los agregados solubles son atributos de calidad críticos (CQA) para las preparaciones de proteínas bioterapéuticas. La introducción de la columna BEH450 SEC proporciona un rango de peso molecular superior extendido que mejora significativamente la resolución en comparación con una columna de exclusión por tamaño basada en HPLC de igual tamaño de poro.
El uso de la columna BEH450 en serie con la columna BEH200 proporciona un intervalo de peso molecular expandido que se puede utilizar para el análisis de agregados diméricos y multiméricos de un anticuerpo monoclonal con un importante incremento de la sensibilidad, la resolución y del rendimiento.
El uso conjunto de un sistema ACQUITY UPLC H-Class Bio y las columnas SEC BEH200 de 1,7 µm y BEH450 de 2,5 µm proporciona los siguientes beneficios:
Referencias
(1) Cromwell ME, Hilario E, Jacobson F. Protein aggregation and bioprocessing. AAPS J. 2006; 8:E572-9.
(2) Rosenberg AS. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. The AAPS Journal. 2006; 8:501-7.
(3) Koza S, Fountain KJ. Advances in Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Macromolecular Proteins. Waters Application Note 720004618EN. 2013 February.
(4) Hong P, Koza S, Fountain KJ. Analysis of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled with Mass Spectrometry Under Non-Denaturing Conditions. Waters Application Note 720004254EN. 2012 March.
Para mayor información:
D´AMICO Sistemas S.A.
Distribuidor exclusivo Quantachrome Instruments en Argentina
Paracas 51 (C1275AFA) Buenos Aires
Tel.: (54 11) 4306-0920 (líneas rotativas)
ventas@damicosistemas.com
www.damicosistemas.com
Descripción de las muestra
Todas las muestras se diluyeron en fase móvil a menos que se haya indicado lo contrario. Las proteínas fueron compradas como estándares individuales o como mezclas. La muestra mAb IgG1 es el biofármaco trastuzumab que se analizó pasada su fecha de vencimiento. Las concentraciones de la muestra fueron de 1,0 mg/ml (nominal).
Condiciones experimentales (a menos que se indique lo contrario)
Condiciones cromatográficas
Sistema:ACQUITY UPLC H-Class Bio con horno calefactor para columnas de 30 cm.
Detección: Detector ACQUITY UPLC TUV con celda de titanio de 5 mm de paso óptico
Detector Light scattering Wyatt miniDAWN TREOS
Longitud de onda: 280 o 214 nm
Columnas: ACQUITY UPLC PrST SEC, 450Å, 2.5 μm, 4.6 x 150 mm (p/n 176002996) y 4.6x 300 mm (p/n 176002997)
ACQUITY UPLC PrST SEC, 200Å, 1.7 μm, 4.6 x 150 mm (p/n 186005225) y 4.6x 300 mm (p/n 186005226)
Columna HPLC: Silica-based, diol bonded 450Å, 8 μm, 7.8 x 300 mm
Temperatura de la columna: Ambiente
Temperatura de la muestra:10 °C
Volumen de inyección: 5 μL
Caudal:0.35 mL/min
Fase móvil: Fosfato de sodio 5 mM, Cloruro de sodio 250 mM, pH 6.8 (preparado usando la tecnología Auto•Blend Plus)
Gradiente: Isocrático
Standard:BEH450 SEC Protein Standard Mix (p/n 186006842)
Software:Waters Empower® 3 Software
Waters UNIFI® Information System
Wyatt Astra Software
Detalles experimentales de Cross-linking
Los agregados covalentes de IgG de alto peso molecular se prepararon usando el estándar Waters® Intact mAb (p/n 186006552) y un reactivo de cross-linking específico de lisina BS3 (Pierce, Rockford, IL). Las reacciones se realizaron con el anticuerpo a una concentración final de 10 mg/ml y una relación molar reactivo a proteína de aproximadamente 5:1 durante 30 minutos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Comparación de UPLC-SEC y HPLC-SEC de IgM y IgM dímero
Los resultados obtenidos con la columna de UPLC BEH450 son comparados con los obtenidos con una columna de HPLC con partículas de 8 µm base sílica en la separación de IgM, una inmunoglobulina pentámera con un peso molecular de 900 KDa y la forma di-pentámera de peso molecular 1.8 MDa (Figura 1). La cantidad de muestra inyectada y el caudal de trabajo son ajustados en base a la diferente geometría de las columnas usadas y ambos análisis son realizados en el mismo sistema cromatográfico Acquity UPLC H-Class Bio.
La columna BEH450 produjo una mejor separación significativa entre la forma di-pentámero y pentámera y una mejora de la sensibilidad con una altura de pico mayor en un 50% en comparación con la columna de HPLC. Esta notable mejora en la eficiencia de separación se debe principalmente a la disminución de tamaño de partícula. Además, se puede observar que el rango de resolución de pesos moleculares de la columna BEH450 se extiende por encima del dipentámero basado en la observación de las formas multiméricas del dímero de elución más temprana en el cromatograma.
Expansión del rango de pesos moleculares en el análisis de las agregaciones de mAb
La eficiencia excepcional proporcionada por la columna de la BEH450 para la separación de proteínas por encima del rango de peso molecular de la columna BEH200 (aproximadamente 450 kDa) sugiere que el uso de las dos columnas en serie puede proporcionar algunas ventajas para las separaciones UPLC-SEC a lo largo de un amplio intervalo de pesos moleculares. La comparación de la separación lograda con las columnas BEH200 y BEH450 solas (300 mm de longitud) y la versión de longitud de 150 mm de las dos columnas conectadas en serie (BEH200 seguida por BEH450) para la mezcla de proteínas estándar Waters® BEH200 SEC (p/N 186006518) se muestra en la Figura 2. Como la contrapresión generada por la columna de tamaño de partícula 1,7 µm BEH200 es mayor que la de la columna de tamaño de partícula 2,5 µm BEH450, la columna BEH200 se colocó primero en la serie para este estudio. El resultado de esta configuración de dos columnas se muestra en el panel central de la Figura 2.
Mediante el uso de dos columnas en serie se aumenta el rango de pesos moleculares superiores funcionales de la separación como se observa en la separación de la tiroglobulina y su dímero en comparación con la separación lograda usando una columna de 200Å sola. Además, para las formas de peso molecular inferior hay una mejora en la resolución en comparación con el uso de la columna de la 450Å solo tal como lo demuestra la separación mejorada entre IgG y BSA.
El uso de dos columnas SEC de diferente tamaño de poro puede proporcionar separaciones a través de un rango más amplio de pesos moleculares. Un ejemplo de tal separación es el agregado multivalente, trímero, dímero y las formas monoméricas de un anticuerpo monoclonal. Para demostrar esto fue procesada una muestra de IgG (P/N 186006552) para generar formas diméricas y multiméricas covalentes con el fin de obtener una muestra estable con un nivel abundante de especies multiméricas de un anticuerpo. Esta muestra se utilizó para definir el intervalo de peso molecular de las especies de mAb agregadas que pueden ser separadas por las columnas BEH200 y BEH450. La química de entrecruzamiento produce altos niveles de especies multiméricas que se caracterizan con facilidad por la medición de múltiples ángulos de dispersión de luz láser (MALS). Sin embargo, la polidispersidad de los picos incrementada debido a la naturaleza de la reacción de reticulación, también resulta de enlaces no cruzados del reactivo a las proteínas.
Los cromatogramas que se muestran en la Figura 3 junto con las asignaciones de picos basados en los datos de MALS demuestran las ventajas de usar las columnas BEH200 y BEH450 en serie. Para la separación utilizando sólo la columna BEH200 se obtiene una excelente resolución entre el monómero y dímero pero cuando se compara con la separación observada en la columna BEH450, la distribución de las formas agregadas de mayor peso molecular eluyen cerca del trímero y del volumen de exclusión total de la columna. Mediante el uso de las dos columnas en serie (cromatograma central en la Figura 3), la distribución de formas agregadas más altas se puede observar, mientras que se consigue una mejor resolución entre el monómero y el dímero en comparación con el uso de la columna de la BEH450 sola.
A continuación se investigó el uso de las columnas BEH200 y BEH450 en serie para el análisis UPLC-SEC de un anticuerpo IgG1 bioterapéutico (trastuzumab). Con el fin de generar una muestra más relevante para este estudio, la muestra de trastuzumab se sometió a una serie de eventos de congelación - descongelación para aumentar los niveles de agregados no covalentes en la muestra. Los niveles de los agregados fueron evaluados utilizando la columna BEH200 (longitud 300 mm) y las columnas BEH200 y BEH450 en serie (longitud de 150 mm c/u). Estos resultados (Figura 4) muestran que el uso de las dos columnas en serie proporciona una distribución de las formas agregadas multiméricas donde se puede observar una mejor separación entre las especies agregadas diméricas y triméricas en comparación con la columna BEH200 sola. Por el contrario, el uso de la columna BEH200 sola proporciona una mejor separación de los fragmentos de mAb que resultan de la escisión en la región bisagra de la mAb(4).
Mediante la evaluación de la variación del perfil cromatográfico durante el transcurso del estudio de congelación-descongelación se puede observar visualmente para ambas configuraciones de columnas que el nivel general de trímero soluble y agregado multimérico está aumentando. Ambas configuraciones de columnas también proporcionan resultados comparables para la determinación de los niveles relativos de dímero, así como para la sumatoria del trímero y el agregado multímero (Figura 5). Esta comparación cuantitativa requiere considerar el trímero y las formas multiméricas en forma conjunta debido que cuando se usa la columna BEH200 sola no es posible una integración exacta. El uso de las columnas BEH200 y BEH450 en serie proporciona un beneficio significativo para esta aplicación en el que las formas de trímeros y tetrámeros están más resueltos en comparación con el uso de la columna BEH200 sola. Además, la distribución de formas agregadas mayores en valencia que trímero y tetrámero se puede controlar mejor.
Estos resultados son consistentes con los presentados previamente (Figura 2) que demuestran que el intervalo de peso molecular superior de la columna BEH200 para una proteína globular es aproximadamente la de la tiroglobulina (667 kDa), casi el peso molecular de la IgG tetrámero (600 KDa). Por comparación, el intervalo de peso molecular superior de la columna BEH450 es aproximadamente la de IgM di-pentámero (1,8 MDa) que es el peso molecular de una IgG 12-mer. Esta información adicional proporcionada por la columna BEH450 de tamaño de poro más grande puede ser beneficioso en la caracterización de una proteína bioterapéutica ya que además de el nivel de agregación de la proteína, la valencia de esa agregación puede alterar potencialmente la inmunogenicidad.
CONCLUSIONES
Tanto los niveles y la naturaleza de los agregados solubles son atributos de calidad críticos (CQA) para las preparaciones de proteínas bioterapéuticas. La introducción de la columna BEH450 SEC proporciona un rango de peso molecular superior extendido que mejora significativamente la resolución en comparación con una columna de exclusión por tamaño basada en HPLC de igual tamaño de poro.
El uso de la columna BEH450 en serie con la columna BEH200 proporciona un intervalo de peso molecular expandido que se puede utilizar para el análisis de agregados diméricos y multiméricos de un anticuerpo monoclonal con un importante incremento de la sensibilidad, la resolución y del rendimiento.
El uso conjunto de un sistema ACQUITY UPLC H-Class Bio y las columnas SEC BEH200 de 1,7 µm y BEH450 de 2,5 µm proporciona los siguientes beneficios:
- Mayor resolución y disminución de los tiempos de corrida en comparación con métodos tradicionales de cromatografía liquida de exclusión molecular
- Un amplio rango de pesos moleculares (aproximadamente 10 kDa a 1800 kDa)
- Posibilidad de observar la distribución de las formas agregadas mAb multivalentes, manteniendo una excelente resolución entre el agregado dimérico y las especies mAb monoméricas
Referencias
(1) Cromwell ME, Hilario E, Jacobson F. Protein aggregation and bioprocessing. AAPS J. 2006; 8:E572-9.
(2) Rosenberg AS. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. The AAPS Journal. 2006; 8:501-7.
(3) Koza S, Fountain KJ. Advances in Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Macromolecular Proteins. Waters Application Note 720004618EN. 2013 February.
(4) Hong P, Koza S, Fountain KJ. Analysis of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled with Mass Spectrometry Under Non-Denaturing Conditions. Waters Application Note 720004254EN. 2012 March.
D´AMICO Sistemas S.A.
Distribuidor exclusivo Quantachrome Instruments en Argentina
Paracas 51 (C1275AFA) Buenos Aires
Tel.: (54 11) 4306-0920 (líneas rotativas)
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