Identificación de Bacterias mediante el Análisis de Ésteres Metílilicos de Ácidos Grasos por GC-FAME

Introducción

Por muchos años, el análisis de ácidos grasos de cadenas cortas (ácidos grasos volátiles, VFAs) ha sido de uso rutinario en la identificación de bacterias anaeróbicas. En numerosos trabajos científicos, los ácidos grasos entre 9 y 20 carbonos de largo han sido utilizados para caracterizar el género y especie de bacterias, especialmente organismos Gram negativos no fermentadores. Con la aparición de las columnas capilares de sílice fundida (la cual permite la recuperación de los hidroxi ácidos y la resolución de muchos isómeros), es práctico utilizar la cromatografía de gas de toda la célula para identificar una amplia gama de organismos.

Ácidos grasos encontrados en bacterias
Más de 300 ácidos grasos y compuestos relacionados se han encontrado en la bacteria analizada en la Investigación MIDI. La riqueza del contenido de la información de estos compuestos, se puede estimar considerando no solamente la presencia o ausencia de cada ácido, sino que además se pueden utilizar los datos en forma cuantitativa. Mientras que la habilidad teórica para diferenciar entre 2300 combinaciones distintas no es práctica debido a la distribución no aleatoria dentro de los distintos grupos de bacterias, el gran número de ácidos grasos le crea un gran poder al Sherlock MIS para "nombrarlos".
Sherlock MIS usa ácidos grados con un largo de 9-20 carbonos. El sistema cuantifica y nombra automáticamente los picos. Las cadenas de ácidos ramificadas predominan en algunas bacterias Gram positivas, mientras que los hidroxi ácidos de cadenas cortas usualmente caracterizan los lipopolisacáridos de las bacterias Gram negativas. Las estructuras de algunos de estos compuestos se muestran en la Figura 1.

En esta nota, todos los compuestos se refieren a ácidos grasos, a pesar de que los compuestos reales pueden ser aldehídos, hidrocarburos o dimetil acetales, y son analizados típicamente como metil ésteres. El sistema para nombrarlos usado en esta nota, es contar carbonos desde el extremo "omega" (e.j. el opuesto al extremo carboxilo) e indicar las otras estructuras que se conocen. Las distintas combinaciones de las características pueden resultar en números muy grandes de ácidos grasos. Aunque la mayoría de las identificaciones de los ácidos grasos han sido confirmadas por técnicas de espectroscopía de masa, algunos siguen apareciendo como desconocidos o con una designación de una letra donde la posición del doble enlace y/o la configuración no ha sido confirmada.

Cultivo de la bacteria
El perfil celular más estable y reproducible del acido graso, se logra regulando cuidadosamente las condiciones de crecimiento.
Varios trabajos científicos reportan los efectos de la temperatura en el crecimiento y las distintas medidas de crecimiento en la composición de los ácidos grasos de la bacteria. Para minimizar estas variables, se elige una temperatura específica y un medio para cada librería. Por ejemplo, la mayoría de las bacterias aeróbicas crecerán bien en Agar de Caldo de Soja Tripticasa (TSBA), la cual consiste en 30g de Caldo de Soja Tripticasa y 15g de agar (BBL). Aquellas bacterias aeróbicas que no crecerán bien en TSBA, crecen en el medio que es usado comúnmente para su crecimiento en el laboratorio (e.j. Legionella en un buffer carbonatado con extracto de levadura, y Haemophilus en chocolate agar). La temperatura elegida para la base de datos del TSBA es 28°C, para habilitar el crecimiento de una amplia gama de organismos. Una base de datos independiente, CLIN, usa 35°C y sangre agar (base de Soja Tripticasa) como estándar, con un medio especializado para organismos específicos.

Para la bacteria anaeróbica, la placa basada en los datos, utiliza cultivos desarrollados en los 35°C en una infusión de cerebro-corazón con suplementos. La base de datos que contiene más de 800 entradas fue desarrollada (por el VPI Anaerobe Lab) utilizando cultivos durante la noche de un caldo de levadura de peptona y extracto de glucosa.

Cuando se usan placas de cultivos, el periodo de crecimiento es de 24 horas para las aeróbicas y 48 horas para las anaeróbicas. La estandarización de la edad fisiológica de los cultivos es obtenida mediante la elección de un sector de la raya de un cuadrante en la placa (Figura 2). Los organismos de crecimiento lento pueden ser incubados durante el periodo de tiempo necesario para obtener el crecimiento adecuado.

Reactivos
Se requieren cuatro reactivos para separar los ácidos grasos de los lípidos:
Reactivo 1, Saponificación- 45g de hidróxido de sodio, 150ml de metanol y 150ml de agua destilada. Dispensar mediante el uso de una micropipeta, asegurando la reproducibilidad y permitiendo un gran número de ensayos por día.
Reactivo 2, Metilación- 235ml de acido clorhídrico 6.0N certificado y 275ml de alcohol metílico. Con gotas de esta solución, se obtendrá un pH inferior a 1.5 y la metilación del ácido graso. El éster metílico del acido graso en este punto, es poco soluble en la fase acuosa.
Reactivo 3, Extracción- 200ml de hexano y 200ml de metil ter-butil eter. Esto extraerá el éster metílico del ácido graso a la fase orgánica para usar en el cromatógrafo gaseoso.
Reactivo 4, Limpieza de la Muestra- 10.8g de hidróxido de sodio disuelto en 900ml de agua destilada. Este procedimiento reduce la contaminación de la recubierta del puerto de inyección, la columna y el detector. Se pueden realizar más de 10.000 análisis en una columna antes de necesitar cualquier mantenimiento.

Procesamiento de la muestra
Los cinco pasos para procesar los extractos preparados para el GC se ilustran en la Figura 3.

Recolección- Se utiliza un bucle de 4mm para recolectar 40mg de células bacterianas desde el tercer cuadrante (segundo o primer cuadrante si hay un crecimiento lento) de la placa. Las células se colocan en un tubo de cultivo limpio de 13x100.

Saponificación- Se añade 1.0ml del Reactivo 1 a cada tubo que contiene a las células. Los tubos están sellados en forma segura con tapas recubiertas con teflón, agitados brevemente y calentados en un baño de agua en ebullición por aprox. 5 minutos, una vez que el tubo es agitado vigorosamente por 5-10 segundos, se devuelve al baño de agua para completar los 30 minutos de calentamiento.

Metilación- Se destapan los tubos enfriados, se añaden 2ml del Reactivo 2. Los tubos se tapan y se agitan brevemente. Luego del agitado, los tubos se calientan durante 10 ± 1 minutos a 80 ± 1°C. (Este paso es crítico en tiempo y temperatura.)

Extracción- Adicionar 1.25ml del Reactivo 3 para enfriar los tubos, luego volver a taparlos y voltearlos suavemente en un rotador clínico durante 10 minutos. Los tubos se destapan y la fase acuosa (la inferior) se pipetea afuera y se descarta.

Lavado con base- Se añaden alrededor de 3 ml del Reactivo 4 a la fase orgánica restante de los tubos, los tubos se vuelven a tapar, y se voltean por 5 minutos. Luego se destapan, y alrededor de 2/3 de la fase orgánica se pipetea dentro del vial del GC, el cual se tapa y está listo para el análisis.

Hardware
El Software Sherlock MIS sólo puede usarse con los cromatógrafos gaseosos de la serie Agilent 6890 ,7890 o 6850.

Columna Ultra 2- La columna capilar de 25m x 0.2mm de phenyl methyl silicone fused silica tiene excelente rendimiento cromatográfico y tiempo de vida para el análisis rutinario de los extractos bacterianos. Se requiere una columna que tenga más de 4000 platos teóricos por metro para picos con k=7 a 9. Dado que la fase estacionaria es entrecruzada, hay menos ruido y deriva mientras se ejecuta el programa de temperatura.

Cromatógrafo de Gases- Las rampas de la temperatura programada son desde 170°C a 270°C con 5°C por minuto. Luego del análisis, se aumenta a 300°C permitiendo la limpieza de la columna durante 2 minutos. El detector de ionización de la llama permite un gran rango dinámico y provee una mayor sensibilidad. El gas Carrier es el nitrógeno, y el aire e hidrógeno se usa para sostener la llama.

Automuestreador- Usar un automuestreador permite que el sistema esté operando en forma desatendida hasta 2 días a la vez. A su vez, garantiza una altísima reproducibilidad analítica.

Computadora- La señal electrónica del detector del GC pasa a la computadora donde se realiza la integración de los picos. Los datos electrónicos son guardados en el disco duro (incluyendo las muestras STAT), registrados por el OLCDS ChemStation y la composición del Ester Metílico de ácidos grasos en la muestra es comparada con la base de datos guardada, utilizando el software de perfil de patrón del Sherlock.

Calibración y nombre del pico
El MIS Sherlock utiliza una calibración estándar externa desarrollada y manufacturada por Microbial ID, Inc. El estándar es una mezcla de cadenas lineales de ácidos grasos saturados desde 9 a 20 carbonos en largo (9:0 a 20:0) y cinco hidroxi ácidos. Se añaden todos los compuestos en forma cuantitativa de modo que el rendimiento de la cromatografía de gases puede ser evaluado por el software siempre que se analiza una mezcla de calibración. Los compuestos hidroxi son especialmente sensibles a cambios de relación de presión/temperatura y a la contaminación del revestimiento del puerto de inyección. Como resultado, estos compuestos funcionan como una verificación del control de calidad del sistema.

Los datos del tiempo de retención obtenidos por la inyección de la mezcla de calibración es convertida a datos del Largo de Cadena Equivalente (ECL, por sus siglas en inglés) nombrando el ácido graso bacteriano. El valor de ECL para cada ácido graso puede derivarse en una función del tiempo de retención en relación del tiempo de elución de series conocidas de cadenas lineales de ácidos grasos.

Donde Rtx es el tiempo de retención de x; Rtn es el tiempo de retención del metil estearato del ácido graso saturado anterior a x; Rt(n+1) es el tiempo de retención del éster metílico del ácido graso con elución después de x.
Así, es posible, comparando con el estándar externo, comparar con el valor ECL para cada compuesto tras un análisis. El GC y la columna permite ajustar la ventana al ancho de unidad 0,010 ECL brindando una gran precisión en la resolución de los isómeros. Luego de nombrar los picos en una muestra desconocida, Sherlock compara los valores de ECL para las series más estables (e.j. Cadenas lineales saturadas o cadenas ramificadas de ácidos) con los picos nombrados teóricos de los valores perfectos de la tabla y se puede recalibrar internamente si se detectan suficientes diferencias. Estos valores permiten al sistema ser ejecutados durante un máximo de dos días desatendido sin preocuparse sobre la deriva entre las corridas.

Librerías
Las librerías de Sherlock consisten en más de 100.000 análisis de cadenas obtenidas por expertos y desde colecciones de cultivos. Los cultivos fueron colectados desde todo el mundo para evitar sesgo geográfico potencial. Donde es posible, 20 o más cadenas de especies o subespecies fueron analizadas para realizar la inscripción.

Cuando los subgrupos cromatográficos fueron encontrados dentro de un taxón, fueron encontradas más cadenas para trazar cada grupo. El método de cultivo y la librería correspondiente se indica en el nombre del campo de la muestra y se registra en la computadora. El análisis de una muestra desconocida resulta en una comparación automática de la composición de la cepa desconocida con la guardada en la base de datos usando una matriz de covarianza, el componente principal se analiza y se reconoce la forma con el software.

La matriz de covarianza tiene en cuenta la cantidad de relación de moles-por-moles de la conversión de uno de los ácidos grasos a otro. (e.j. 16:0 a 16:1 debido a la acción de una desaturasa), la cuál puede ocurrir en relación del cambio de la temperatura. El patrón de reconocimiento del software utiliza cálculos de términos cruzados (e.j. relaciones entre cantidades de ácidos grasos) además de la base del compuesto principal. Las diferencias sutiles entre biotipos o subespecies, depende del poder del reconocimiento del patrón del software para discriminar a este nivel. Las librerías son de composición abierta (e.j. no tienen limites de un conjunto finito o de ensayos bioquímicos) y el número de especies en ellas son grandes y creciente. Las librerías sólo son limitadas por la habilidad del MIDI de obtener los números adecuados de cadenas para hacer las entradas. Por supuesto, algunos grupos de bacterias son más susceptibles al análisis de identificación de la composición de ácidos grasos que otros. Esto se refiere a si están disponibles las buenas caracterizaciones de las cadenas y a si las "especies" se pueden justificar en base a la relación del ADN (e.j. la Escherichia coli está relacionada con las especies de nivel de Shigella dysenteriae [ver Brenner, Int. J. Syst. Bacteriol.23:298-307]).

Resumen
El Sistema de Identificación Microbial Sherlock es un sistema preciso y automático para cromatografía gaseosa, el cual identifica alrededor de 1500 especies de bacterias basándose en su único perfíl de ácidos grasos. El sistema puede analizar alrededor de 200 muestras por día, usa un procedimiento de muestra estandarizada para todas las bacterias. Un promedio de 5 minutos por muestra para preparar un lote de 30 muestras. Ya que no se requieren análisis adicionales. El nombramiento es altamente objetivo y reproducible.

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