Determinación de Colorantes Claudia Milena Peña Alvarez, Ing. de Alimentos

Se entiende por colorante a toda sustancia, no considerada alimento en sí, agregada para dar artificialmente color a determinados alimentos y/o teñir papeles, cartones y demás materiales que se utilizan para envolverlos.

Los colorantes tienen aplicación aceptable cuando se usan para tornar más agradable a la vista los alimentos, pero su uso se hace fraudulento cuando son utilizados para cubrir, enmascarar o disimular alteraciones o sustituciones, o engañar sobre la naturaleza del producto.

CRITERIO A SEGUIR
En la investigación de colorantes pueden presentarse fundamentalmente dos casos:

• Determinar cuál es el colorante presente en el producto en estudio.
• Determinar si el producto que se analiza tiene colorantes permitidos o no por la reglamentación vigente.

En este último caso, se puede proceder de la siguiente manera:
Determinar si se trata de un colorante natural (es decir, de origen vegetal o animal) o derivado del alquitrán de hulla.

Si es natural, generalmente no es necesario seguir investigando ya que los colorantes naturales están permitidos por el Código Alimentario Argentino para colorear muchos productos; sin embargo, hay casos en que es necesario determinar con precisión el colorante de que se trata, aunque sea natural, ya que hay productos (pastas frescas, vinos, etc) en que no se permite el agregado de ningún colorante. En este caso se aplicará alguna técnica particular.

Si resulta derivado del alquitrán de hulla, habrá que ver si está permitido o no por el Código Alimentario Argentino. Resulta práctico buscar los colorantes permitidos por técnicas particulares; si ninguno de ellos está presente significa que se trata de un colorante NO PERMITIDO por la reglamentación.

DESARROLLO DEL ANALISIS
Como para poder determinar si el colorante en cuestión es natural (animal o vegetal) o derivado de la hulla (anilinas) hay que saber primero si es de naturaleza ácida o básica para poder encarar la técnica correspondiente.

Se siguen los siguientes pasos:

• Determinar si el colorante es ácido o básico
• Determinar si es natural o derivado de la hulla
• Determinar eventualmente qué colorante es

Preparación de la muestra
Productos líquidos: bebidas fermentadas, alcohólicas, hídricas, vinagres, jugos y zumos de fruta, jarabes, etc.
La muestra original debe someterse a un calentamiento moderado a baño María para facilitar la eliminación de productos susceptibles de impedir, retardar o dificultar la fijación del colorante (alcohol, ácido acético, etc.). Inmediatamente se filtra por papel de filtro para separar las materias precipitadas o en suspensión a fin de obtener una solución transparente.

En el caso de líquidos débilmente coloreados es necesario concentrar por calentamiento a baño María en cápsula de porcelana.

Cuando se trata de un líquido con reacción ácida se neutraliza cuidadosamente con amoníaco hasta obtener un medio bien neutro al papel de tornasol, que permita efectuar las operaciones de teñido de fibras.

Productos sólidos, pastosos o viscosos: caramelos, confituras, pastas de frutas, conservas vegetales y animales, pastas alimenticias, pastelería, condimentos y especias, cereales elaborados, etc.

La muestra original, débilmente triturada, molida o pulverizada, bien homogeneizada (en el caso de pastas se homogeneiza con arena calcinada en un mortero), se trata con agua tibia o caliente para su disolución total o para la extracción de las partes que contengan las materias colorantes.

En el caso de carnes frescas o conservadas (embutidos, etc) se calienta una porción de la muestra desmenuzada (10-12 gr) con 10 ml de alcohol al 50% durante media hora a baño María, se filtra por papel mojado y se recoge el líquido en una cápsula de porcelana para la fijación del colorante.

Cuando se trata de pastas alimenticias, especialmente si son secas (fideos) es aplicable la técnica siguiente: se introducen 20 gr de muestra molida en un pequeño erlenmeyer, se agregan 40 ml de alcohol al 50% y se calienta 15-20 min a B.M. revolviendo frecuentemente. La solución alcohólica filtrada se utiliza para los ensayos de teñido de fibras.

Colorantes ácidos y básicos
El fundamento de las técnicas a usar es el siguiente: si el colorante es ácido se fijará sobre la lana blanca desgrasada, es decir la teñirá, cuando se coloque a ésta con el colorante en medio ácido. Si es básico se fijará a la lana si el medio es alcalino.

Colorantes ácidos
Método de Arata modificado por Sostegni
En un recipiente adecuado (cápsula de porcelana, vaso de precipitado) se colocan 50-100 ml de la muestra preparada según las técnicas generales para la extracción (si contiene alcohol, evaporarlo a B.M.), se agregan 5 ml de HCl al 10%, hebras de lana blanca desengrasada y se hierve durante 3-5 min. Se retira la lana, se lava con abundante agua y se observa. Si la lana se tiñe, se trata de un colorante ácido.

Colorantes básicos
Método de Koenig
En un recipiente adecuado se colocan 50-100 ml de muestra, se agregan 5 ml de amoníaco al 10% o la cantidad necesaria para obtener reacción alcalina, y se procede de la misma manera que en el caso anterior, teniendo la precaución de controlar el pH durante la operación ya que el amoníaco puede volatilizarse por el calentamiento; en este caso se deberá agregar más cantidad hasta restablecer el medio alcalino. Si en este medio la lana aparece teñida se trata de un colorante básico.

Mezcla de colorantes: En este caso se realizan simultáneamente y por separado las dos técnicas vistas anteriormente.

Colorantes naturales y derivados de la hulla
Método de Arata-Posetto
Para poder encarar esta técnica debe conocerse primero la naturaleza del colorante (ácido o básico).

Esquema
El método consta de varios pasos; el primero consiste en fijar el colorante sobre hebras de lana blanca desengrasada y luego desmontarlo en agua; en el segundo paso el colorante recientemente desmontado se fija sobre lanas nuevas, las que son posteriormente desmontadas como antes en agua; en el tercer paso el colorante que se acaba de desmontar es fijado sobre nuevas hebras de lana, y así sucesivamente.

Ya se vio antes que si el colorante es ácido se fija sobre la lana cuando se acidifica el medio, por lo tanto el desmonte se debe efectuar en medio alcalino. Si el colorante es básico ocurre lo contrario, es decir, se fija en medio alcalino y se desmonta en medio ácido.

Técnica
En un vaso de precipitado o cápsula de porcelana colocar 50 ml de muestra. Si el colorante es de naturaleza ácida se agregan 10 ml de HCl al 10% y aproximadamente 7-10 hebras de lana blanca desengrasada para fijar el colorante.Hervir 3-5 min.

Retirar las lanas teñidas, lavarlas con abundante agua, gurdar una hebra teñida para comparar, y colocar el resto de las hebras en otro vaso de precipitado con 50 ml de agua destilada, a la que se agrega amoníaco al 10%. Hervir las lanas en el agua alcalina 3-5 min para desmontar el colorante (que pasa al líquido). Retirar las hebras de lana decolorada, guardar una para comparar y tirar el resto. Aquí concluye el primer paso.

El líquido alcalino que contiene el colorante se calienta hasta eliminar el amoníaco y se acidifica con aprox. 10 ml de HCl al 10%; se colocan nuevas hebras de lana y se rehierve 3-5 min. Se retiran las lanas, se lavan, se guarda una para comparar y el resto se pasa a otro vaso de precipitado con agua alcalina para su desmonte, como se vio antes, concluyendo así el segundo paso.

Para el tercer paso se elimina el amoníaco y se repite todo el proceso visto.

Precauciones: debe cuidarse que la acidez o la alcalinidad no sean demasiado elevadas, ya que los tratamientos muy enérgicos pueden destruir los colorantes dando resultados falsos, y hasta pueden destruirse las hebras de lana. Por eso en muchos casos conviene utilizar ácido tartárico para acidificar, en lugar de HCl. Del mismo modo debe cuidarse de no provocar sobrecalentamientos. Es conveniente también utilizar siempre la misma cantidad de lanas para tratar que el colorante pueda fijarse cuantitativamente en todos los pasos y se puedan comparar las lanas provenientes de cada paso. También es necesario que la cantidad de agua que se utiliza para recoger el colorante en cada desmonte sea siempre la misma, evitando así problemas por dilución del colorante, que influirían en la interpretación de los resultados.

Si el colorante que se está investigando hubiera resultado de naturaleza básica, se empleará el mismo método pero en forma inversa a la vista, es decir, fijándolo a las lanas en medio amoniacal y desmontándolo en medio ácido.

Interpretación
Al finalizr la técnica anterior se tiene una serie de lanas que se fueron guardando para comparar; así, para cada paso habrá dos hebras: una que corresponde al teñido y otra al desmonte del colorante.

En presencia de colorantes naturales (animales o vegetales) la lana de la segunda fijación no debe colorearse. Si la lana de la segunda fijación mantiene su intensidad y la de la tercera se colorea, hay colorantes derivados del alquuitrán de hulla. Como excepción hay algunos colorantes naturales, como el carmín de índigo y la orchilla, que se comportan como si fueran anilinas. En última instancia deberá recurrirse a una cromatografía o a las reacciones individuales de caracterización.

Reacciones particulares
a) Investigación de cúrcuma
El cúrcuma es un colorante de origen vegetal que se extrae del rizoma sano, limpio y seco de Cúrcuma longa L. Se utiliza generalmente para colorear fideos. El Reglamento Alimentario de la Provincia de Buenos Aires autoriza su empleo siempre que en rótulo del producto que lo contenga se declare "coloreado con cúrcuma". Sin embargo, hay ciertos productos en los que el R.A. prohíbe específicamente su uso (por ejemplo, pastas frescas, budines, etc.).

Técnica
Se deseca la muestra, se tritura y se extrae el colorante con etanol de 70°, dejándolo en contacto 24 hs a temp. Ambiente o bien 30 min a B.M. (adaptando un refrigerante a reflujo); se filtra el líquido alcohólico que contiene el colorante y se sigue alguna de las técnicas siguientes:
Se toma una alícuota del extracto alcohólico y se agrega igual volumen de agua destilada, se evapora el alcohol a B.M. y al líquido acuoso restante se le agregan gotas de amoníaco. En presencia de cúrcuma aparece una coloración violeta rojiza.

Una alícuota del extracto alcohólico se evapora a sequedad a B.M. colocando previamente un papel de filtro dentro del recipiente en el que se efectúa la evaporación, de modo que una vez evaporado el alcohol el colorante quede concentrado sobre el papel de filtro; se seca bien este último y se le agregan gotas de una solución de HCl saturada de ácido bórico; en presencia de cúrcuma aparece una coloración rosada a púrpura que varía de intensidad según la cantidad de colorante presente. Puede confirmarse la presencia de cúrcuma secando nuevamente el papel donde se efectuó la reacción y agregando gotas de amoníaco en la zona coloreada de rojo por el reactivo anterior; en caso positivo se observa un viraje hacia el azul verdoso.

b) Investigación de caramelo
Es un producto de color pardo oscuro obtenido por calentamiento de azúcares naturales (especialmente de sacarosa, ya que se forma un colorante de mejor poder de tinción). Es muy utilizado para colorear bebidas como jarabes tipo cola, refrescos, vinagres, etc.

Técnica
En un tubo de ensayo de paredes gruesas se colocan 20-30 ml de muestra y 10-115 ml de éter etílico, se agita suavemente 2-3 min y se decanta el éter en cápsula de porcelana; se deja evaporar éste a temp. ambiente y al residuo se le agregan gotas de solución etérea de resercina al 1% y luego gotas de HCl. En presenecia de caramelo aparece una coloración anaranjada más o menos intensa, que pasa rápidamente al rojo cereza y persiste como mínimo 3 hs.

c) Investigación de cochinilla (o carmín)
Es un colorante rojo o rojo violáceo, de origen animal. Muy difundido en la coloración de bebidas (refrescos, etc.), polvos para preparar postres, etc.

Técnica
En un tubo de ensayo de paredes gruesas colocar 2-3 ml de muestra, acidificar ligeramente con HCl y extraer el colorante con alcohol amílico agitando suavemente para no emulsionar, decantar la capa amílica y lavarla con agua destilada hasta total eliminación del HCl (conviene agregar una pizca de acetato de sodio para asegurar la neutralidad). Sobre el líquido amílico pueden efectuarse las siguientes reacciones:

A una alícuota del extracto amílico se agregan gotas de solución acuosa de acetato de uranilo al 5%, en presencia de cochinilla aparece una coloración verde esmeralda característica.

A otra porción del extracto amílico se agrega gota a gota amoníaco hasta franca alcalinidad; en caso de haber cochinilla aparece una coloración violeta que desaparece por adición de agua de yodo (esto permite diferenciar cochinilla de orchilla).

d) Investigación de orchilla
Es un colorante rojizo-violáceo que se obtiene por aminación y oxidación de sustancias incoloras (las orcinas u orcinoles) extraídas de líquenes, por lo que se considera "colorante artificial de origen natural". La orchilla es uno de los pocos colorantes de origen natural que se comporta como un derivado de la hulla sin seerlo en el método de Arata-Posetto. Por esto muchas veces se hace imprescindible recurrir a reacciones de caracterización de este colorante.

Técnica
En un tubo de ensayo de paredes gruesas se colocan 2-3 ml de muestra, se acidifica con HCl y se extrae con alcohol amílico de igual modo que para cochinilla. Se decanta y se lava la fase amílica y se agrega gota a gota amoníaco hasta alcalinidad. En presencia de orchilla aparece una coloración violácea que no desaparece por adición de agua de yodo.

e) Investigación de luteína
Es un producto amarillo, principal responsable del color de la yema de huevo (el otro colorante de la yema de huevo es la zexantina); también se lo encuentra en el reino vegetal, principalmente en pastos tiernos. Se investiga principalmente en fideos para ver si contienen huevo.

Técnica
Agitar 10 gr de muestra con 15 ml de éter, y por separado otros 10 gr con 15 ml de alcohol de 70°, y dejar ambos en reposo 24 hs. Si el éter queda incoloro y el material teñido, y el alcohol queda coloreado mientras el material es decolorado, indica que hay un colorante extraño a la luteína. En caso que el alcohol y el éter estén coloreados significa presencia de luteína con o sin colorante extra. Una porción de la solución etérea se trata con nitrito de sodio diluido, si se decolora indica que sólo hay luteína.

f) Investigación de tartrazina
Es un colorante amarillo derivado del alquitrán de hulla.

Técnica
Agregando alcohol a la solución acuosa del colorante se produce un precipitado.La solución acuosa toma un color más oscuro por el agregado de NaOH.Con cloruro estannoso se obtiene un precipitado amarillo soluble en ácido oxálico.

Por reducción con amalgama de sodio da el ácido diaminosuccínico: HOOC-CH-NH2-CH-NH2-COOH

La solución de tartrazina tratada a B.M. con polvo de Zn y ácido acético se decolora, y el filtrado expuesto al aire (el filtro también) se torna color rosa; concentrando el filtrado a B.M. para eliminar el acético, el rosa se intensifica y la solución resulta rojiza-anaranjada; este color se fija en lana en medio acético con un débil tono parduzco. Si el filtrado incoloro por la reducción se alcaliniza con NaOH, vuelve el amarillo primitivo de la tartrazina.

Reacciones sobre fibras teñidas: por ser éste un colorante de naturaleza ácida, se lo fija sobre lana blanca desengrasada en medio ácido, como se vio en el método de Arata-Posetto. Las lanas teñidas en la primera fijación se someten por separado a la acción de los siguientes reactivos:

• Con HCl concentrado: oscurece algo
• Con ácido sulfúrico concentrado: oscurece algo
• Con NaOH al 10%: poco cambio
• Con hidróxido de amonio diluido: poco cambio
• Con cloruro estannoso: se decolora y se torna rapidamente roja al aire

Investigación de amarillo crepúsculo
Es un colorante ácido amarillo oro (solución diluida) hasta amarillo naranja (solución concentrada) derivado del alquitrán de hulla.

Técnica
Reacciiones sobre fibras teñidas:

• Con HCl conc.: se vuelve más rojo
• Con ácido sulfúrico concentrado: algo más rojo
• Con NaOH al 10%: más pardo
• Con hidróxido de amonio diluido: no cambia

Investigación de amaranto
Se trata de un colorante ácido rojizo o bordó, derivado del alquitrán de hulla.

Técnica
Algunas de las reacciones de caracterización (no específicas) son las siguientes:

Por reducción con Zn en polvo y ácido acético se decolora, y el color primitivo no aparece por reoxidación al aire ni por tratamiento con permanganato de potasio.

Reacciones sobre fibras teñidas:

• Con HCl conc.: ligeramente más oscuro
• Con ácido sulfúrico conc.: violeta a parduzco
• Con NaOH al 10%: parduzco opaco a rojo anaranjado
• Con hidróxido de amonio diluido: poco cambio

Cromatografía sobre papel
Es un método rápido y eficaz para la identificación y separación de mezclas de colorantes. La técnica descripta a continuación sirve para la identificación rápida de los colorantes permitidos por el Código Alimentario Argentino. El esquema general de trabajo comprende las siguientes etapas:

Preparación de la muestra
Elección de las condiciones de corrida.
Papel
Solvente de desarrollo

Técnica cromatográfica

• Selección de patrones
• Siembra de la muestra
• Desarrollo del cromatograma
• Comparación de las manchas con las de los patrones (Rf y forma).

En el siguiene trabajo práctico se analizarán muestras de productos en los que se suelen incorporar colorantes sintéticos hidrosolubles, con el fin de constatar si los colorantes presentes están permitidos por el CAA.

Técnica
Como muestra se utilizará la solución acuosa de colorante/s extraído/s por teñidos y desmontes sucesivos de hebras de lana blanca (hasta el tercer desmonte) y posterior concentración por calentamiento hasta aproximadamente 1 ml (evitando la carbonización).

Se usará papel Whatman n°1 en el sentido de formación de la hoja.
Como solvente de corrida se empleará la siguiente mezcla: amoníaco (d=0.88):agua destilada, 1:99, v/v.

Se empleará cromatografía ascendente.

Se sembrarán los patrones de colorantes de uso permitido por el CAA.

Trazar con un lápiz una línea a 2 cm del extremo del papel que va en contacto con el líquido de desarrollo, y otra línea a 15 cm de la primera. Marcar los puntos de aplicación sobre la primera línea a una distancia no menor de 2 cm entre sí y del borde lateral del papel. Sembrar la solución de colorantes aislados por medio de un capilar en los puntos marcados, teniendo la precaución que las manchas no superen los 0,5 cm de diámetro. Reforzar la mancha secando al aire o con un secador de pelo y volviendo a sembrar en el mismo lugar, hasta obtener la intensidad adecuada.

Sembrar también los patrones, logrando una intensidad similar a la de las manchas.
Se utilizarán cubas de vidrio provistas de tapa y una varilla de vidrio para colgar el papel. Este debe tener por lo menos 3 cm menos de ancho que la cuba. El solvente de corrida se coloca en la cuba y se deja media hora con la tapa puesta para que se sature el ambiente interior. Se suspende la tira sembrada sin que toque el líquido de desarrollo, durante media hora más, para equilibrarla con la atmósfera de la cuba. Luego se baja el papel hasta que el borde inferior se sumerja 2 mm aproximadamente. Se deja correr hasta la marca de los 15 cm, se retira el papel y se seca de inmediato con una corriente de aire seco caliente, operación que se debe realizar en menos de 1 min, y se determina el Rf de la mancha

Se compara la o las manchas problema con las correspondientes a los patrones.